纳米载体逆转肿瘤耐药的研究进展

黄 菁，王玉珏，卢丽萍

0 引言

癌症是全球人类死亡的主要原因之一。据世界卫生组织的报告，每年新发癌症病例已超过1 240万，死亡病例已超过760万。目前大约有50种不同类型的化疗药物用于治疗大约200种不同类型的癌症，导致化疗药物因缺乏特异性而产生严重的副作用，从而损坏正常器官。另外，化疗药物虽然可有效杀死癌细胞，但随着使用时间的延长(也可发生于较短的时间之后)，肿瘤细胞自身即可抵抗这些药物，即肿瘤多药耐药(MDR)作用。为提高疗效，减少毒副作用，逆转MDR作用，研究者对纳米颗粒的药物递送系统(DDS)，如脂质体、胶束、微细胞、脂质复合物、金纳米粒子、磁性纳米粒子、碳纳米管、树枝状合物、量子点、聚合物-药物共轭物等分子进行研究。将药物负载或封装在纳米粒子上，更特异地对癌细胞提供装载药物，形成了新型的逆转MDR工具。本文概述了纳米颗粒的生物学特性，并重点对利用DDS逆转肿瘤MDR的途径和方法进行综述。

1 纳米药物载体的生物学特性

对于大多数药物，传递系统需要解决的问题有：药物溶解度、生物利用度、胃肠道吸收、靶向性、缓释作用、疗效、副作用等，而纳米载体将药物包封于亚微粒中，可以调节释药速度，增加生物膜透过性，改变药物在体内的分布，提高生物利用度等。①许多半衰期短的药物可能需要每天重复给药多次，但制备成缓释药物后，将极大延长药物作用时间，能解决口服易水解药物的给药途径问题，从而大大降低药物与胃蛋白酶等消化酶接触的机会。②纳米载体经特殊加工后，可达到靶向输送的目的，更准确地对准组织或器官，减少药物对人体的不良反应，实现靶向给药。③载药纳米粒可以改变膜转运机制，增加药物对生物膜的透过性，有利于药物透皮吸收与细胞内药物发挥。④纳米颗粒具有缓释效应，使血浆药物浓度波动小，降低药物的毒副作用[1]。⑤纳米颗粒口服后，主要通过肠道的派伊尔结吸收进入淋巴循环，可避免肝首关效应，增加一些药物的生物利用度。总之，纳米药物载体在医药领域的应用极为广泛，可在保证药物作用的前提下，减少给药剂量，提高药物的利用率、疗效，减少药物的副作用；可消除特殊生物屏障对药物作用的阻碍，能携带多种化学药物，使载体及其生物学降解产物易于消除。

2 应用DDS克服肿瘤多药耐药的途径和方法

2.1 应用DDS对MDR蛋白抑制剂的传递 药物的活性取决于其在细胞质和细胞核中的浓度。部分蛋白质(如P-gp、MRP、BCRP、LRP)可运输内化药物分子到细胞外部环境；GST通过酶活性解毒药物分子。因此，为了使药物分子有效，抑制相应蛋白质或酶是首要关注的问题。已知这些蛋白质或酶的几种抑制剂可以下调其表达。其中，选择性抑制P-gp作用的药物包括维拉帕米、地尔硫卓、奎尼丁、环孢菌素A、阿司咪唑、伊曲康唑、阿霉素-镓-转铁蛋白结合物；同时发现，红霉素、伊曲康唑、二氟沙星、氧氟沙星、利福平、消炎痛、NSAID类药物、多柔比星镓转铁蛋白结合物等能抑制MRP的活性。染料木素、雌酮等是BCRP抑制剂的代表[2]。研究证实，多种GST抑制剂，包括依他尼酸、6-巯基己醇衍生物、硝唑尼特、芦荟大黄素等，通过增强肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性来调节耐药性[3]。当抑制剂足以对抗耐多药蛋白的功能时，它们对靶位点不仅没有特异性作用，还可阻止正常器官靶蛋白的功能，从而产生副作用，如心脏毒性、肾毒性和神经毒性等。为避免这种情况，对肿瘤进行特异性的靶向抑制十分必要。因此，可将这些抑制剂封装在纳米颗粒中并加以特定修饰，使抑制剂可以在特定的肿瘤细胞中发挥下调MDR蛋白表达的功能，这样药物可单独传递或通过纳米粒子的管理，实现对肿瘤部位的抑制。最近研究表明，通过含有抗肿瘤药物和外排泵抑制剂的纳米载体，如环孢素、维拉帕米和Tariquidar等抑制多药耐药蛋白，在肿瘤细胞多药耐药逆转方面有着很好的前景[4-5]。

另外，研究发现，与游离环孢霉素A或仅载阿霉素药的颗粒相比，共同封装环孢菌素A和阿霉素的纳米粒子，可使阿霉素对白血病细胞的功效高2倍[6]。另一项研究中提出，转铁蛋白同时含有维拉帕米和阿霉素脂质体，可以加速细胞内化，使耐阿霉素的白血病细胞中阿霉素有更高浓度的聚集，证实与未修饰的脂质体相比，修饰性纳米脂质体能够逆转MDR[4]。此外，与非靶向制剂相比，包被紫杉醇和Tariquidar的聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)纳米粒在乳腺癌中的疗效也有所提高[5]。可知，利用纳米粒子实现抑制剂和化疗药物的靶向传递，有望成为更加安全、有效的治疗肿瘤MDR的方法。

2.2 应用DDS对MDR靶向基因的递送 基因治疗是指在活体将特定的遗传物质导入靶细胞，改变靶细胞的表型或从基因水平替代、阻抑、控制或攻击细胞中有缺陷或有害的基因，以达到预防或改变某一特定疾病状态的目的[7]。基因治疗已成为癌症治疗的强大工具，其中，RNA干扰技术给耐药逆转提供了新的高效特异性的方法，该技术是将外源性或内源性双链RNA导入细胞后，引起与该段RNA同源的mRNA产生特异性降解，其相应的基因受到抑制，这种发生在转录后的基因沉默现象称为RNA干扰。siRNA对肿瘤MDR的调节作用在于其能直接降解mdr-1mRNA，降低P-gP的表达，从而恢复肿瘤耐药细胞对药物的敏感性。近年来，有研究者尝试通过核酸(RNA干扰，siRNA等)纳米粒子控制肿瘤ABC转运蛋白的表达[5]。由于游离siRNA在血清中不稳定且在细胞中的提取量较少，而载siRNA的运载纳米粒子较游离siRNA系统更稳定，具有目标特异性，因而能增强基因转染[8]。Jiang等[9]用化学合成的siRNA纳米粒转染具有耐药性的乳腺癌细胞，在RNA和蛋白水平上抑制MDR1基因表达，选择性地增加了通过P-糖蛋白运送的阿霉素在细胞内的积累，并恢复了细胞对阿霉素的敏感性。Chen 等[10]用阳离子脂质体纳米载体包载siRNA (c-Myc) 与DOX对 NCI/ADR-RES 细胞进行体内外实验，结果表明，联合治疗体系效果对MDR癌症具有良好的协同作用，与对照组相比差异有统计学意义。另外，配体修饰的纳米粒子也能在siRNA传递过程中解决靶向问题，这是在MDR肿瘤组织中下调特异性基因的先决条件。Kang等[11]用阳离子脂质体共载了siRNA和化疗药物MEK抑制剂，将其用于肿瘤治疗，结果发现，siRNA可以下调Mcl1和pERK1/2蛋白表达且有效减少肿瘤细胞存活时间。Saad等[12]发现，装载阿霉素和MRP-1及Bcl-2siRNA的脂质体能够诱导细胞凋亡，逆转肺癌多药耐药。最近，双序列治疗策略用于传递包被双特异性抗体靶向微胶粒的siRNA和药物，以阻断多药耐药基因的表达。Baselga等[13]应用拉帕替尼和赫赛汀联合的双靶向药物和单独使用赫赛汀或拉帕替尼治疗早期乳腺癌，结果表明，两药联合应用所产生的效果明显高于单独使用其中任何一种药物，且无明显心脏毒性事件的发生。因此，递送抗肿瘤药物到多药耐药肿瘤细胞的载体非常重要，可控制通过纳米颗粒核酸传递基因表达的水平。

2.3 应用DDS调节药物的摄取途径 被包封在纳米颗粒的药物相对于游离药物，具有不同的药代动力学特性。游离药物通常通过扩散穿过细胞膜。当它们穿过细胞膜时，膜上的药物外排泵可感测游离药物分子，并防止其进入细胞质或使其容易被ABC转运捕捉后排出。纳米载体将成为有效克服游离药物外排问题，并增加其疗效的工具。纳米载体是通过非特异性内吞途径进入细胞，并以“无形”的形式穿过细胞膜，从而防止药物被外排泵识别。这种类型的内吞作用称为“隐形”的内吞作用，可以产生细胞内较高的药物浓度。这些颗粒由内涵体转运，在近核(或深细胞质内)远离膜ABC转运蛋白区域释放。按照这些步骤，纳米载体能够绕过ABC转运蛋白，同时，抗肿瘤药物可以屏蔽细胞解毒酶作用[14]。丁宝月等[15]发现，由于DOX-PAMAM-HA可以通过避开耐药蛋白如P-糖蛋白对药物的外排作用，以胞吞形式入胞，从而增加药物的细胞内摄取，导致与DOX溶液相比，DOX-PAMAM-HA可明显提高在耐药肿瘤细胞内的摄取。因此，利用纳米载体在肿瘤细胞中调节药物摄取途径的作用，将成为逆转MDR的有效工具。

2.4 应用DDS对靶向肿瘤血管生成的治疗 肿瘤细胞的生长和发展需要葡萄糖、矿物质和氧，最初它们通过附近的血管提供，但随着肿瘤的增长，肿瘤细胞越来越远离血液供应。其继续增长必须有新的血管提供营养，如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1～2 mm3。肿瘤侵袭转移是肿瘤治疗失败的主要原因，而在肿瘤发生侵袭转移的过程中，血管生成发挥重要作用。在肿瘤细胞分泌的血管生成调节因子的帮助下，在肿瘤微环境中新血管由预先存在的血管形成，这个过程被称为肿瘤血管生成。为控制肿瘤生长，可尝试抑制肿瘤血管生成，此过程涉及下调促血管生成因子的分泌或增强血管生成抑制因子的活性以及向肿瘤血管的内皮细胞(TECS)传递抗肿瘤药物，此过程称为抗血管生成的治疗。肿瘤血管是极易损伤的，有100～600 nm的内皮细胞间隙，间隙长度取决于肿瘤类型、恶性程度和疾病的阶段。直径为100 dnm左右的纳米颗粒通过增强细胞通透性和保留(EPR)效应，主要应用于聚集肿瘤血管和肿瘤细胞的肿瘤组织，这是实体瘤中的普遍现象(在一些低血管瘤的情况下例外，如前列腺癌或胰腺癌)。小于10 dnm的纳米粒子穿过肿瘤血管上皮细胞(TECs)并迅速被清除，从而导致较短的血液半衰期。而TECs为多药耐药肿瘤细胞提供营养支持，药物通过靶向纳米颗粒特异性递送到TECs，是一种有效治疗该类型恶性肿瘤的方法。因此，10～100 dnm的颗粒将适合针对体内靶向肿瘤。临床上，针对抗阿霉素肿瘤，一旦癌细胞对药物产生耐药性，抗肿瘤药物将很难被输送到肿瘤细胞进行治疗，导致治疗失败。但承载阿霉素的小PEG-LP(100 dnm左右)，可通过EPR效应抵抗肿瘤细胞功能，可用于治疗乳腺癌、卵巢癌、AIDS相关的卡波济氏肉瘤等[16]。

整合avb3、氨肽酶N(CD13)、血管内皮生长因子(VEGF)的受体(VEGF-R2，神经纤毛-1)、肿瘤血管内皮标记(TEMs)等促进血管内皮细胞生长的因子大多由TECs分泌和表达，针对TECs配体或抗体修饰的纳米粒子能够有效递送抗肿瘤药物到TECs并发挥作用。Abu-Lila等[17]认为，运载铂离子的脂质体提供同TECs相互作用的表面分子，从而导致患有黑色素瘤的小鼠有显著的抗血管生成活性。最近，Bai等[18]发现，装载K237肽的纳米粒子用于递送药物给TECs，能够有效治疗P-gp过表达与紫杉醇耐药的结肠癌。这些靶向治疗的方法可应用于MDR癌症治疗中的抗血管生成治疗。

另外，对于耐阿霉素肾癌的靶向治疗，大颗粒纳米载体(约300 dnm)表现最小的EPR效应，并能优先将阿霉素传送到TECs；小颗粒载体(约100 dnm)主要通过EPR效应直接作用于阿霉素耐药肿瘤细胞。通过大颗粒传递的阿霉素的主要功能是杀死TECs，导致中断肿瘤脉管系统，不能继续为肿瘤细胞提供营养，最终引起细胞凋亡或在血液供应依赖的方式下抑制肿瘤细胞生长。因此，用载药纳米颗粒的抗血管生成靶向治疗，还具有对化疗耐药肿瘤逆转化疗药物耐药的作用。

3 展望

由于自我防御机制，肿瘤细胞表现对化疗药物耐药，药物分子失效，最终导致癌症治疗失败，从而使患者因治疗无效而死亡。为逆转肿瘤细胞的抗药性，在特定的肿瘤类型中确定导致MDR的关键因素非常重要。基于关键因素的成功识别，应用DDS技术控制相关的影响因素，可使化疗药物易于传递给耐药的肿瘤细胞，通过细胞对化疗的敏感性以及恢复药物分子活性来克服肿瘤细胞的MDR。随着对纳米载体技术的药物传递系统在肿瘤耐药的机制研究的深入和临床诊断水平的不断提高，肿瘤多药耐药的治疗有望取得更大的进步。

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