RP-HPLC法测定酮洛芬凝胶中药物含量

2014-08-15沙延淳杨祝仁杨红玉

实用药物与临床 2014年10期

石莉，张晶，李乐，沙延淳，邓波，杨祝仁，杨红玉

0 引言

疼痛是运动系统常见病，见于组织定性损伤、关节退行性病变、肩周炎、腱鞘炎等疾病。酮洛芬(Ketoprofen)又名酮基布洛芬，是一种2-芳基丙酸非甾体抗炎药，具有抗炎、镇痛和解热作用，对风湿、类风湿性关节炎、脊髓炎、痛风等具有较好疗效[1]，是目前临床应用较多的抗炎镇痛药物之一。利用口服药物控制症状往往导致胃肠道及全身性的不良反应[2]。凝胶剂直接作用于患处，几乎不参与全身循环[3-4]，外用凝胶制剂可以有效避免或缓解口服酮洛芬带来的胃肠道不良反应。

酮洛芬凝胶为国家药品标准收载的品种[5]，采用内标法测定酮洛芬凝胶中的药物含量，存在局限性。为了更好地控制酮洛芬凝胶的质量，在广泛查阅文献[6-15]与前期试验的基础上，笔者建立了RP-HPLC外标法测定酮洛芬凝胶中药物含量，该方法可有效检出酮洛芬杂质。

1 仪器与试药

L-3000 RIGOL高效液相色谱仪(北京普源精电科技有限公司)，Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm，迪马公司)。酮洛芬原料药(湖北迅达药业股份有限公司，含量：99.7%，批号：KPO-1102026)，酮洛芬凝胶(自制，批号：110701、110702、110703，规格：10 g∶0.3 g)，色谱级乙腈(山东禹王实业有限公司)，磷酸二氢钾(分析纯，天津市博迪化工有限公司)，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH值至3.0)-乙腈(50∶50)为流动相，检测波长为255 nm，流速为1.0 mL/min；柱温：室温；进样量：10 μL；外标法。

2.2 专属性试验

2.2.1 样品制备空白辅料：精取处方量各空白辅料，制备空白凝胶，精密称取本品适量置100 mL量瓶中，流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，离心(12 000 r/min) 15 min，取上清液滤过，取续滤液，即得。凝胶样品溶液：精密称取凝胶0.33 g(约相当于酮洛芬10 mg)，置100 mL量瓶中，流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，离心(12 000 r/min) 15 min，取上清液滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。见图1。

2.2.2 结果空白辅料与空白溶剂基本一致，在酮洛芬主峰处无明显吸收，不干扰本品的测定。

图1 酮洛芬色谱图

2.3 线性关系与范围精密称取酮洛芬对照品10.50 mg，置10 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含1.05 mg的溶液。分别精密吸取0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度。分别精密吸取10 μL溶液，注入液相色谱仪中，测定色谱峰面积。以进样量为横坐标、色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程：Y=3 717.5 X-72.678，r=0.999 9。上述试验结果表明，酮洛芬在0.525～1.575 μg范围内线性关系良好。

2.4 溶液稳定性试验按含量测定项下方法，制备供试品溶液，避光放置，分别于配制后0、2、4、6、8 h取样测定，记录峰面积，所得酮洛芬峰面积的RSD值为1.42%。实验结果表明，该溶液在8 h内稳定。

2.5 中间精密度试验由3名实验人员，分别在3 d配制供试品溶液1份，每人取样2次，精密量取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算样品的含量。RSD为1.13%(n=6)，表明本测定方法中间精密度良好。

2.6 重复性试验按含量测定项下方法处理样品(n=6)，配制供试品溶液，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，含量RSD为1.34%，说明本方法重复性良好。

2.7 准确度试验称取酮洛芬对照品8、10、12.5 mg，分别置于100 mL量瓶中，再按处方比例加入空白辅料，加流动相适量，超声溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，按含量测定项下方法处理样品，精密量取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率，见表1。由表1可见，各浓度下的平均回收率均在96.90%～101.17%之间，平均回收率为98.41%，RSD为1.35%，说明本方法回收率良好。

表1 酮洛芬回收率(n=3)

检测限和定量限：逐级稀释含量测定项下的对照品溶液，测定样品峰的峰高，同时测定相同条件下的色谱基线噪声，当S/N≈3时，检测限为0.5 ng；当S/N≈10时，定量限为5 ng。

2.8 供试品含量的测定精密称取本品适量(约相当于酮洛芬10 mg)，置100 mL量瓶中，加流动相适量，超声溶解，放冷至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀；取上述溶液适量，离心(12 000 r/min) 15 min，取上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，另精密称取酮洛芬对照品适量，加流动相溶解，制成0.1 mg/mL的溶液，作为对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。按照上述色谱条件和检测方法，对3批中试样品及市售药品进行测定。三批供试品的测定结果分别为100.20%、100.08%、100.10%。

2.9 光照试验及光照对含量测定的影响试验中发现，酮洛芬对光敏感。为了进一步了解光照对酮洛芬凝胶的影响，进行了酮洛芬凝胶光照试验的研究。

取本品适量，置强光照射[(4 500±500) Lx]条件下，分别于5、10 d取样，按含量测定项下方法处理样品，取续滤液10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2。

图2 酮洛芬光照试验色谱图

由图2可知，随着光照时间的增加，2号峰峰面积有显著增加。通过文献调研和前期试验，推断2号峰物质为1-(3-benzoylphenyl)ethanone，该物质为美国药典酮洛芬项下有关物质D[16]，欧洲药典酮洛芬项下有关物质A[17]。通过购买1-(3-benzoylphenyl)ethanone杂质对照品(EP)，得到图2中B图谱，确定2号峰物质为1-(3-benzoylphenyl)ethanone，即酮洛芬杂质A(EP)。

比较光照0、5、10 d的数据，记录杂质A的峰面积百分比，计算杂质A与酮洛芬的相对保留时间RRT、酮洛芬的含量百分比，结果见表2。

表2 光照试验结果

结果表明，经光照，酮洛芬含量明显降低，杂质A峰面积百分比明显增加。而且随着光照时间的延长，杂质A明显增加，杂质A为酮洛芬的光照降解产物。

3 讨论

3.1 凝胶样品处理方法的筛选因为本品选用卡波姆为凝胶基质，该高分子物质不适合进入液相色谱系统。如何选择一种适宜的方法去除卡波姆，成为RP-HPLC法测定本凝胶中酮洛芬含量的关键。笔者尝试了透析法、离心法、超滤法等一系列方法，最终选择离心法，用于制备含量测定样品。该方法简便、快捷，可靠。

3.2 离心处理条件的筛选精密称取酮洛芬凝胶适量(约相当于酮洛芬30 mg)，置100 mL量瓶中，加流动相适量，超声使溶解，放冷至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀；于不同条件下离心处理，取上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，制备供试品溶液。见表3。由表3可知，4 ℃下，本品经12 000 r/min离心处理效果较好，离心时间为10～15 min。

3.3 含量测定方法关于酮洛芬含量测定方法的文献较多，包括滴定法、紫外可见分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用(LC-MS)等。本文在广泛查阅文献的基础上，建立了RP-HPLC法测定酮洛芬凝胶中药物含量，该方法能够有效分离并确认了酮洛芬的光降解杂质1-(3-benzoylphenyl)ethanone，这一点在其他含量测定方法文献中未有涉及。