五味子药材中木脂素提取工艺优选及同时测定其不同产地9种木脂素的含量

崔 妮，王 青，王 莹，王鹏远，张桃莉，顾 宜，王晓娟*

0 引言

五味子是木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，习称“北五味子”。其味酸、甘，性温,有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功能。用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心悸失眠等症[1]。五味子中含有多糖、挥发油和木脂素类成分[2-3]，其中木脂素类成分与五味子的抗肝脏损伤、抗氧化作用明显相关[4]，临床应用较广泛，但不同产地药材中木脂素类成分存在一定差异，且文献报道仅涉及五味子甲素、五味子乙素、五味子醇乙等含量较高成分的含量测定[5-8]，而HPLC同时测定多种木脂素类成分含量测定的方法鲜有报道。本试验以不同产地五味子为研究对象，对木脂素类成分的提取方法进行优选，并建立同时测定其中9种木脂素类成分含量的方法，为五味子药材的来源鉴别和质量控制提供依据。

1 仪器与试药

岛津LC-2010AHT，LC solution色谱工作站(日本岛津公司)；TD51001型电子分析天平(赛多利斯仪器有限公司)；DL-720超声仪(浙江石浦海天电子仪器厂)。

五味子醇甲、Gomisin D、Gomisin H、五味子醇乙、Gomisin G、Gomisin B、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素(中国科学院昆明植物研究所，纯度均>98%)；五味子药材采自15个不同产地，分别为黑龙江省的双城、齐齐哈尔、佳木斯、鸡西、双鸭山，吉林省的公主岭、四平、白山、通化、延吉，辽宁省的抚顺、丹东、鞍山、开原、葫芦岛，以上产地五味子药材经鉴定均为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实。甲醇、乙腈(美国Fisher公司)；水为三蒸水(实验室自制)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18(2) (150 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；检测波长：235 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；流动相：甲醇-水梯度洗脱(梯度洗脱程序见表1)。

表1 梯度洗脱程序(%)

2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取对照品五味子醇甲13.90 mg，Gomisin D 2.44 mg，Gomisin H 4.34 mg，五味子醇乙23.44 mg，Gomisin G 2.45 mg，Gomisin B 11.00 mg，五味子甲素11.59 mg，五味子乙素5.15 mg，五味子丙素2.25 mg，加甲醇溶解，并定容至10 mL量瓶中，摇匀，即为对照品储备液；再精密吸取上述对照品储备液1 mL至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即为含量分别为五味子醇甲 27.80 μg/mL、Gomisin D 4.88 μg/mL、Gomisin H 8.68 μg/mL、五味子醇乙46.88 μg/mL、Gomisin G 4.90 μg/mL、Gomisin B 22.00 μg/mL、五味子甲素23.18 μg/mL、五味子乙素10.30 μg/mL、五味子丙素4.50 μg/mL的混合对照品溶液，摇匀，备用。

2.3 正交试验与结果 根据单因素预实验，确定甲醇为提取溶媒，选取影响提取工艺的主要因素溶剂体积A、提取次数B、提取时间C，进行L9(34)正交设计试验，因素水平见表2[9-12]。

表2 因素水平表

以总含量为指标，选用L9(34)正交试验表进行实验，结果及方差分析见表3、表4。

表3 正交试验结果

表4 方差分析

由极差分析结果可知，影响木脂素成分提取因素为A>C>B，且溶剂倍数具有显著性差异，提取次数及时间无显著性差异，对木脂素类成分的提取影响较小。从试验操作简便性和成本方面考虑，最终确定决明子中木脂素类成分提取的最佳工艺为A2B3C2，即100倍甲醇超声提取3次，每次1 h。

取五味子药材粉末(过三号筛)约0.4 g，精密称定。置具塞锥形瓶中，按表2设计的9种工艺进行超声提取，过滤，合并滤液至100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。按“2.1”项下的色谱条件进行测定，色谱图见图1。

图1 混合对照品(A)及供试品溶液(B)HPLC图

2.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.4、0.5、2.5、5.0、8.5、10.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制得混合对照品系列液。分别吸取20 μL注入高效液相色谱仪，测定。以各成分的峰面积为纵坐标(Y)、对照品浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程。混合对照品用甲醇稀释后，进样测定，至信噪比分别为10和3时，得各对照品的定量限及检测限。结果见表5。

2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，稀释1.25倍后进样20 μL，连续5次，计算色谱峰峰面积RSD，即为日内精密度。结果五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、Gomisin B、Gomisin D、Gomisin G、Gomisin H的RSD分别为1.97%、1.93%、0.58%、1.95%、2.04%、1.09%、1.05%、1.62%、1.65%；连续检测3 d，2次/d，计算色谱峰峰面积RSD，即为日间精密度。结果五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、Gomisin B、Gomisin D、Gomisin G、Gomisin H的RSD分别为1.31%、1.61%、1.83%、2.03%、2.12%、2.64%、2.06%、1.81%、0.93%。

表5 9个有效成分的回归方程、相关系数、线性范围、定量限和检测限

2.6 重复性试验 取齐齐哈尔五味子样品5份，按“2.3”项下分别制备供试品溶液，吸取20 μL进样，测定峰面积，计算五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、Gomisin B、Gomisin D、Gomisin G、Gomisin H的RSD分别为2.16%、0.40%、2.29%、1.61%、1.54%、1.84%、0.89%、2.63%、1.41%。

2.7 稳定性试验 取齐齐哈尔五味子样品供试品溶液10 μL分别于0、2、4、8、12、24 h进行测定。五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、Gomisin B、Gomisin D、Gomisin G、Gomisin H的RSD分别为1.66%、1.34%、0.90%、2.65%、1.54%、1.58%、0.96%、1.33%、1.01%。

2.8 回收率试验 取已知含量的五味子药材(齐齐哈尔)粉末6份，每份约0.2 g，精密称定。分别加适量对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件测定，计算回收率。五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、Gomisin B、Gomisin D、Gomisin G、Gomisin H的平均回收率分别为99.00%、98.06%、101.36%、98.73%、101.45%、101.65%、98.41%、100.45%、100.05%，RSD分别为2.81%、2.04%、2.42%、2.30%、2.33%、2.74%、2.89%、2.75%、1.82%。见表6。结果表明，本方法回收率良好。

表6 回收率试验结果(n=6)

2.9 样品测定 取15个不同产地的五味子药材约0.4 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备15份供试品溶液，分别吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪中，测定峰面积，计算含量。结果见表7。

表7 样品测定结果(mg/g，n=3)

3 讨论

为了确定五味子中9种被测成分的最佳色谱分离条件，分别对流动相、检测波长、柱温进行了优化。由于样品中成分较多，等度洗脱无法将所有成分完全分离，所以采用梯度洗脱。笔者比较了甲醇-水、乙腈-水等梯度洗脱条件，发现甲醇-水即可使各被测成分之间均达到良好的分离，故选其作为流动相进行梯度洗脱。通过对不同柱温和流速下色谱保留行为的考察发现，当柱温为30 ℃、流速为1.0 mL/min时，分离效果最佳。

为使五味子药材中的木脂素类成分尽可能提取完全，预试验比较了超声与回流提取对各成分的影响，结果发现差异较小，超声较为方便，故选择超声提取方法，以各种木脂素类成分的总含量为指标，进行L9(34)正交试验。结果表明，100倍量甲醇超声提取3次，每次1 h提取效率较高。

预试验结果显示，五味子样品中各成分因含量有较大差异，故在正式试验时，依据各成分间比例配制混合对照品溶液，使15个不同产地五味子样品含量均在线性范围内，保证测量的准确性。

本试验测定15个不同产地五味子中9种木脂素类成分含量，结果表明，不同产地结果差异较大，其中木脂素类成分以吉林四平最高(22.94 mg/g)，黑龙江双城较低(12 mg/g)，可能与当地的地理位置和气候有关。

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