MEA与FLAG方案治疗难治性复发性急性髓系白血病疗效及安全性分析

章 亮,周 晖,陈小会

0 引言

难治性复发性急性髓系白血病(Refractory and relapse acute myeloid leukemia，rrAML)是成人恶性血液疾病的主要类型，预后较差。药物联合化疗仍是rrAML的主要治疗手段[1]。当前rrAML的化疗方案主要有米托蒽醌+依托泊苷+阿糖胞苷(Mitoxantrone+etoposid+cytarabine,MEA)方案及氟达拉滨+阿糖胞苷+重组人粒细胞集落刺激因子(Fludaraine+cytarabine+recombinant human granulocyte colony stimulating factor,FLAG)方案，但临床仍缺乏两种方案治疗rrAML疗效及安全性的系统性比较及评价。本研究对rrAML患者分别按照MEA、FLAG方案化疗，比较两种化疗方案的疗效及安全性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2009年6月至2013年6月在本院治疗的rrAML患者68例。入选标准：①符合《恶性血液病诊治和疗效标准》中相关诊断标准[2]，并经流式细胞术、骨髓形态学、染色体、融合基因检查确诊；②按标准方案诱导治疗2个疗程后无效，或第1次完全缓解后在6～12个月内复发(早期复发)及12个月后复发(晚期复发)，或复发≥2次；③体能状态(ECOG)≤2分；④签署知情同意书。排除标准：①伴有严重心、肝、肺疾病或恶性肿瘤；②合并严重感染或代谢性疾病；③首次发病的AML患者；④其他类型的白血病患者；⑤M3型AML；⑥已发展至晚期，无治愈希望者。将68例患者采用SPSS 17.0产生的随机数字表随机分为2组，每组34例，两组年龄、性别、白细胞计数(WBC)、复发病程、分型等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 两组一般资料比较(例，%)

1.2 化疗方法 MEA组按照MEA方案化疗。米托蒽醌(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：65271809)静脉滴注，10 mg/d，第1～3天；阿糖胞苷[上海医药(集团)有限公司华联制药厂，批号:147944]静脉滴注，100～150 mg/(m2·d)，第1～7天；依托泊苷(四川三精升和制药有限公司，批号：33419420)静脉滴注，100 mg/d，第1～5天。

FLAG组按照FLAG方案化疗。氟达拉滨(扬州奥赛康药业有限公司，批号：75607679)静脉滴注，50 mg/d，第1～5天；阿糖胞苷[上海医药(集团)有限公司华联制药厂，批号:147944]静脉滴注，100 mg/(m2·d)，第1～5天；重组人粒细胞集落刺激因子(齐鲁制药厂，批号：135968091)皮下注射，300 μg/d，第0～5天。

两组在按上述化疗方案治疗基础上，均给予地西他滨 20 mg/(m2·d)，qd×(5～9)d去甲基化治疗，维持1 h以上。在化疗期间对症给予水化、碱化、保护脏器、漱口、坐浴、止吐、抗感染等治疗。两组均化疗1个疗程后评价疗效。

1.3 观察指标 在化疗期间严密监测血常规、凝血功能、电解质、肝肾功能，并进行心电图、胸部CT、腹部超声、骨髓穿刺等检查，记录感染、败血症、粒细胞缺乏及腹泻、发热、口腔炎等非血液学毒副反应发生情况。化疗1个周期结束后，次日根据临床表现、血象、骨髓象评价化疗效果。化疗效果评价参考《恶性血液病诊治和疗效标准》分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、未缓解(NR)，总缓解=CR+PR。

1.4 ID4基因甲基化检测 化疗前均收集两组患者骨髓以备用。取两组中CR患者化疗前及化疗后的骨髓标本，采用甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)、Methylight-PCR对ID4基因甲基化进行定性及定量检测。

1.4.1 MS-PCR检测 ①引物设计：ID4基因甲基化特异性引物参照文献[3]设计，由上海捷瑞生物技术有限责任公司合成，扩增片段长度186 bp。②PCR反应：PCR反应总体积25 μL，包含上游、下游引物各25 pmol/L，2×GoTaqGreen master mix 12.5 μL，模板DNA 2 μL，补充无菌双蒸水至25 μL。反应条件：95 ℃预变性15 min，94 ℃变性50 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；随后经72 ℃延伸7 min完成扩增。

1.4.2 Methylight-PCR检测 ①引物设计：MYOD1作为内参基因，引物及探针参考文献[3]设计，由上海捷瑞生物技术有限责任公司合成。②PCR反应：PCR反应总体积20 μL，包含ID4基因甲基化特异性引物及探针各50 pmol，2×EpiTectMethylight Master mix 10 μL，补充无菌双蒸水至20 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s；于60 ℃进行FAM荧光收集。

通过-△Ct=-(Ct甲基化-Ct内参)计算ID4基因甲基化水平，-△Ct越大ID4基因甲基化程度越高[4]。

2 结果

2.1 化疗效果 经过1个疗程化疗后，FLAG组总缓解率为70.95%，高于MEA组的52.94%，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.2 不良反应发生情况 两组化疗后败血症、非血液学毒性反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)；FLAG组侵袭性真菌病、粒细胞缺乏发生率高于MEA组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。FLAG组感染性发热、粒细胞缺乏持续时间分别为(8.72±2.01)d、(20.44±3.50)d，长于MEA组的(6.55±1.78)d、(18.27±2.87)d，两组比较差异有统计学意义(t1=2.80，t2=3.32,P均<0.05)。

表2 两组治疗效果比较(例，%)

表3 两组不良反应发生率比较(例，%)

2.3 化疗前、后ID4基因甲基化水平 MEA组经化疗后7例达CR，FLAG组10例达CR，两组CR患者化疗前ID4基因甲基化水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，化疗后FLAG组CR患者ID4基因甲基化水平低于MEA组的CR患者，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4 两组CR患者化疗前、后ID4基因甲基化水平比较

3 讨论

AML约占成人白血病的75%，多耐药细胞株的产生使得AML治疗反复失败，并发展成为rrAML[5]。异基因造血干细胞移植是目前治疗rrAML最有效的方法，但此前的再诱导缓解仍然需要化疗药物实现。目前临床治疗rrAML的化疗药物主要是大剂量的阿糖胞苷联合二线药物、二线药物联合化疗或联合靶向治疗新药等，其中以MEA、FLAG等方案化疗较为常见，但临床仍缺乏两种方案治疗rrAML的疗效及安全性的系统性评价。

余丹等[6]研究发现，MEA与FLAG治疗1个疗程后，总缓解率分别为61.14%、64.38%，差异无统计学意义；而治疗2个疗程后，FLAG方案组总缓解率为82.34%，高于MEA方案组的66.13%，差异有统计学意义(P<0.05)，但FLAG方案组骨髓抑制发生率高于MEA方案组，持续时间也较长。Takami等[7]研究也得到相似结论，米托蒽醌、依托泊苷与阿糖胞苷较少发生交叉耐药，毒副反应较少，但治疗1～2个疗程后，总缓解率不如FLAG方案高。本研究中，经1个疗程化疗后，FLAG组总缓解率为70.95%，高于MEA组的52.94%，差异有统计学意义(P<0.05)，与余丹等报道基本相符，提示FLAG方案治疗rrAML效果优于MEA。两种化疗方案中均应用大剂量阿糖胞苷。阿糖胞苷是作用于细胞周期S期的特异性药物，其疗效主要依赖于癌细胞内活性成分单磷酸阿糖胞苷(Ara-CTP)的浓度，剂量越大其直达癌细胞细胞核中的浓度就越大，对癌细胞的杀伤作用越大[8]。Claus等[9]研究发现，氟达拉滨可协同阿糖胞苷,使阿糖胞苷在rrAML中的Ara-CTP浓度增加2～7倍，同时氟达拉滨对耐药的细胞有直接毒性作用，抑制癌细胞DNA修复，增强癌细胞杀伤作用。而近年研究也发现，重组人粒细胞集落刺激因子可使0期癌细胞进入S期，提高阿糖胞苷的化疗敏感性[10]。这也许是FLAG方案治疗rrAML疗效优于MEA方案的主要原因。

值得注意的是，阿糖胞苷对癌细胞的杀伤作用具有剂量依赖性，其对正常细胞的毒性作用也呈剂量依赖性。虽然FLAG治疗rrAML的总缓解率更高，但感染与骨髓抑制发生率也显著升高。葛健等[11]研究发现，对rrAML患者按FLAG方案化疗1个疗程后，粒细胞缺乏、感染发生率分别达50.03%、59.35%，非血液学毒副反应发生率也较高，但程度均较轻。本研究中，FLAG组将阿糖胞苷的剂量适当调低，为100 mg/(m2·d)，低于MEA组的150 mg/(m2·d)，化疗后感染、粒细胞缺乏发生率分别为47.06%、52.94%，略低于葛健等报道水平，但仍高于MEA组，且持续时间也长于MEA组。此外，国外学者研究认为，FLAG方案的骨髓抑制作用不仅与阿糖胞苷有关，还可能与氟达拉滨有关。Fedele等[12]对rrAML采用FLAG方案诱导，随后采用去氟达拉滨方案巩固，结果66%以上的患者仍采集到足够的CD34+细胞。而以FLAG方案诱导，以去阿糖胞苷为巩固方案，结果又有69%以上的患者未采集到足够的CD34+细胞。因此Fedele等认为，氟达拉滨会损伤患者的造血干细胞，但其机制有待进一步研究。

AML的发病与发展与基因缺失、突变密切相关。人体ID4基因甲基化与实体瘤，如直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等转移及复发密切相关。近年研究发现，在非霍奇金淋巴瘤、AML中检测到ID4基因甲基化提示有复发可能[9,13-14]。这些研究提示：靶向诱导抑癌基因的表达有可能成为AML治疗的新途径。杨华等[15]研究报道，在23例rrAML患者中，14例检出ID4基因甲基化阳性，阳性率为60.87%，给予地西他滨等去甲基化药物化疗后，ID4基因甲基化水平显著下降。本研究对两组患者分别按MEA、FLAG治疗基础上给予去甲基化药物地西他滨治疗，化疗后ID4基因去甲基化水平均有所下降，但FLAG组ID4基因去甲基化水平下降更明显。于锦香等[16]研究发现，地西他滨单药化疗的CR率为60.13%，地西他滨联合CAG化疗的CR率为72.96%。蔡成森等[14]也得到相似结论，地西他滨联合AAG方案化疗的疗效优于地西他滨。上述研究得出一个结论，其他化疗药物有可能提高地西他滨的去甲基化功能。本研究中，FLAG组经化疗后，ID4基因甲基化水平显著低于MEA组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示FLAG方案对地西他滨去甲基化的增强作用优于MEA，这可能也是FLAG方案治疗效果优于MEA方案的一个原因，但其机制有待进一步研究。

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