淫羊藿苷减轻阿伐他汀诱导的斑马鱼颅内出血

李春梅

(山东省临沂市中医院，山东 临沂 276000)

脑出血是临床常见急重症之一，具有较高的死亡率和致残率。在我国，脑出血发病率占脑卒中的比例远高于西方国家[1]，且脑出血患者1个月内病死率超过40%，大多数幸存者常遗留严重的神经功能缺损[2]。目前尚没有治疗脑出血的肯定、有效的措施。应用较多的治疗手段是微创血肿清除术，及重组组织型纤溶酶原激活物的药物治疗[3]，且目前对于脑出血的基础研究远落后于疾病发展。充分利用我国丰富的中草药资源，从中发现对脑出血有防治作用的中药有效成分具有重要意义。本研究采用阿托伐他汀制备转基因斑马鱼颅内出血模型，观察中草药淫羊藿的主要有效成分淫羊藿苷(icariin, ICA)对该模型的保护作用，为淫羊藿苷用于临床防治脑出血提供基础药理学依据。

1 材料

淫羊藿苷(南京替斯艾么中药研究所，经HPLC测定其纯度≥96%)；荧光显微镜(Leica荧光显微镜，德国Leica公司)；所用试剂均为分析纯；所用斑马鱼为Tg(fli-1:EGFP);Tg(gata1:DsRed)双转基因斑马鱼从斑马鱼国际资源中心(Oregon, PO)购买。

2 方法

2.1 斑马鱼的饲养 斑马鱼饲养在28 ℃反渗水，光照按14 h日光和10 h无光为周期，每天早上9∶00开始光照，每日以丰年虾及热带鱼粮于早上及下午喂饲两次。

2.2 斑马鱼胚胎的收集 于受精后4 h(hours post fertilization, 4 hpf)淘汰掉未受精及发育不健全的胚胎，剩下健康胚胎在28.5 ℃反渗水中培养。

2.3 模型制备及药物治疗 健康胚胎培养至22 hpf拆蛋壳后，分为5组(每组10～15只，重复2次)：空白对照组(Control)、模型对照组(Atorvastatin)、淫羊藿苷预处理组(ICA 30、100、300 μM)。除空白组和模型对照组外，其余3组均给予不同浓度的淫羊藿苷作用2 h，至24 hpf时更换并清洗含有淫羊藿苷的培养液，添加1 μM阿托伐他汀继续培养24 h，至48 hpf时采用荧光显微镜观察颅内出血情况，并计算出血面积的百分比。

图1 实验流程图

3 结果

淫羊藿苷预防性给药2 h对阿托伐他汀诱导的斑马鱼颅内出血模型具有明显的保护作用。3个浓度的淫羊藿苷均可减少颅内出血情况，其中100 μM和300 μM的作用较为显著，与模型对照组相比，斑马鱼颅内出血面积百分比明显减少，且有统计学意义(见图2)。

注：A:白色箭头所指为出血区;B:各组斑马鱼颅内出血面积百分比量化分析(n=10～15，重复2次，vsAtorvastatin组*P<0.05，空白对照组斑马鱼没有损伤情况，其颅内出血面积百分比记为零)。 图2 淫羊藿苷预防性给药2 h对阿托伐他汀诱导的斑马鱼颅内出血模型的影响

4 讨论

本实验采用的双转基因Tg(fli-1:EGFP);Tg(gata1:ds Red)斑马鱼既能在内皮细胞中表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)呈现出完整的血管轮廓，又可以红色(Red)荧光清楚的呈现出红细胞聚集及出血的情况，这种双转基因模型是理想的观察胚胎血管系统的可视性模型。采用的工具药阿托伐他汀是人工合成的羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMGCR)抑制剂，一种典型的调血脂药物，同时也具有调节血管内皮细胞的作用。在人类和啮齿类动物体内，HMGCR功能被抑制可破坏正常脑内血管的稳定性和完整性，导致进行性的脑血管膨胀、破裂，类似脑内海绵状血管畸形出血损伤的表现[4]。采用药物手段体外抑制HMGCR的活性，可引起血管生成受损及血管发生样的双相改变[5]，有研究证明阿伐他汀用于斑马鱼胚胎后干扰HMGCR正常功能，引起发育阶段的斑马鱼颅内出血[4]，其机制可能是由于HMGCR作用被抑制，介导的下游信号途径受到干扰，从而使成血管细胞聚集成新生血管的过程减弱，使得血管脆弱易渗漏甚至破裂[6]。

淫羊藿为我国丰富的中药材，小檗科(Berberidaceae)淫羊属(EpimediumL)植物，被《中国药典》收载[7]。其主要有效成分之一淫羊藿苷，属于8-异戊烯黄酮醇苷化合物，分子式C33H40O15，分子量

676.67。大量体外实验表明，淫羊藿苷对血管内皮细胞具有积极的保护和促进作用[8-10]。本实验结果提示经淫羊藿苷预处理2 h，明显的减轻阿托伐他汀引起的转基因斑马鱼颅内出血，说明淫羊藿苷对脑出血具有一定的预防作用。淫羊藿苷作用的发挥可能与其保护颅内血管内皮细胞不被阿托伐他汀破坏，提高血管抗损伤能力，保持血管的稳定性和完整性，减轻颅内血管的渗漏或破裂有关，但其确切的作用机制有待于进一步研究。

[参考文献]

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