microRNA－219－2－3p在胃癌中的表达及其作用机制初探

金锦莲，吴发明，周海燕，谢晓晶，王新宇

（三峡大学第三临床医学院／葛洲坝中心医院消化内科，湖北宜昌 443002）

胃癌是世界上的第四大常见肿瘤，在肿瘤死亡原因中排名第二位。目前，研究表明晚期胃癌患者中只有约20%的患者生存期超过5年［1］。肿瘤的发生、发展是多种内源性和外源性因素累积的结果。胃癌的发生的内源性因素通常与饮食习惯和胃部幽门螺杆菌感染率增加有关［2］，外源性因素则包括遗传、饮食、胃泌素激素水平以及其他慢性胃部炎症因子等［3］。

microRNA（miRNA）是一种非编码的小片段RNA，参与mRNA的降解和翻译调控。miRNA通过靶向结合于mRNAs的3′非翻译区互补序列从而诱导mRNA降解或抑制翻译，起到对基因转录和翻译的调节作用［4］。近年来，miRNAs被认为是一种肿瘤抑制基因，其通过对基因表达的调节而对肿瘤的发生和发展起着重要作用［5］。在人类和鼠中，miRNA－219（miR－219）前体转录产物主要是由 miR－219－1和 miR－219－2基因编码。前体转录产物经过剪切后成为成熟的miRNAs：包括从前体转录产物的5′端转录的 miR－219－5p；分别从 miR－219－1前体转录成熟的 miR－219－1－3p和 miR－219－2前体转录成熟的 miR－219－2－3p。已有研究表明在恶性星形细胞瘤［6］和肝癌中 miR－219－5p表达量下降［7］，最新的研究报道，miR－219－2－3p在胃癌细胞系 MGC－803中表达量有所降低，且过表达 miR－219－2－3p可以诱导胃癌细胞的凋亡，提示 miR－219－2－3p可能作为胃癌的候选抑癌基因［8］。

基于以上研究背景，本研究拟对本院2011～2012年进行手术治疗的胃癌患者组织中miR－219－2－3p表达量的变化及其可能作用机制进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011～2012年在本院接受胃癌切除手术的82例胃癌患者，所纳入的患者均签订了知情同意书。在病理医师的指导下，切除适量的胃癌组织以及邻近的癌旁组织（距离癌组织3cm）。手术切除后的新鲜标本立即置于液氮中冷冻保存。所有患者年龄45～70岁。所有胃癌标本均经过病理诊断确认。

1.2 方法

1.2.1 实时聚合酶链反应（real－time RT－PCR） 组织中总RNA抽提采用Trizol（Takara）试剂盒方法。采用Taqman miRNA的方法并通过real－time RT－PCR技术定量检测82例胃癌病例中癌组织和邻近正常组织的 miR－219－2－3p表达水平。逆转录反应体系为：5×RT buffer，0.1MDTT，200U／mL逆转录酶，40U／mL RNase抑制剂。反应条件为37℃条件下55min，70℃条件下15min，－20℃保存。在ABI公司生产的7500real－time PCR仪上进行反应，反应体系为20μL，包括1 μL逆转录产物，1×Universal TaqMan Master Mix和1×Taqman probe／primer Mix（Invitrogen）。

1.2.2 细胞培养及转染实验 本研究采用的细胞株为人胃癌细胞株MGC803（胃黏液癌，低分化），购自中国医学科学院基础医学科学研究所细胞资源中心（北京）。培养基：DMEM培养液（Gibco公司），10% 胎牛血清（Gibco公司）和链霉素（100 mg／mL），青霉素（100U／mL）。在5%CO2，湿度大于95%的37℃培养箱中培养。转染前24h分别于6孔板接种2×105／孔。24h后（约80%细胞贴壁后）进行转染，参照Lipofectamine TM2000说明书及参考文献进行操作［9］。转染6～8h后换液，培养48h后裂解细胞，并进行相关指标分析。

1.2.3 蛋白免疫印迹法（Western blot）分析 将 MGC803的全细胞成分及标本组织匀浆用细胞裂解缓冲液裂解。裂解缓冲液的成份为20mM Tris－HCI、1mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、1mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、1mM钒酸钠、0.2mM。收集蛋白并进行蛋白浓度测定（BCA法）。制备好的蛋白样品放置于－80℃冰箱保存备用。电泳：每泳道上样10μg蛋白。用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）后转硝酸纤维素膜。转膜后封闭非特异性结合蛋白。然后加入一抗4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗室温孵育1h。ECL显色拍片。一抗包括 ERK1／2、p－ERK、β－actin。

1.2.4 细胞增殖测定 各组细胞分别转染 miR－219－2－3p，miRNA阴性对照，转染后的细胞用含10%CCK－8的（Dojindo；日本）培养基在37℃孵育，可以视觉上看到颜色变化。分别于转染后0、24、48、72、96h在450nM 和630nM 波长处测定吸光度，计算细胞增殖速率。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行数据处理。miRNA的real－time PCR结果采用2－△△Ct方法对目的基因在癌组织及癌旁组织中的表达量进行相对定量分析。计量资料用表示，组间比较采用单因素方差分析或t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌组织中miR－219－2－3p的表达变化与临床病理参数的关系分析 与癌旁组织比较，59.7%（49／82）肿瘤组织中miR－219－2－3p表达量降低。作者进一步对 miR－219－2－3p表达与临床病理特征的关联性进行分析，结果如表1，miR－219－2－3p在胃癌组织中的表达与临床分期相关性表现为，miR－219－2－3p表达量越低，患者临床分期级别越高（P＜0.05），而与年龄、性别、癌变部位、Lauren′s分类、淋巴结侵袭无关（P＞0.05）。

图1 miR－219－2－3p过表达对 MGC803细胞增殖影响

2.2 miR－129－2－3p对胃癌细胞增殖的影响 由图1细胞增殖实验结果可知，与空白对照组（未经任何处理）及阴性对照组（转染空质粒）相比，在 MGC803细胞过表达 miR－129－2－3p后（miR－249－3p组），细胞数目显著降低，且具有时间效应关系，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 miR－219－2－3p过表达对ERK表达的影响 与阴性对照组相比，过表达 miR－219－2－3p后，细胞水平的磷酸化 ERK1／2（p－ERK）表达水平显著降低，而总磷酸化水平没有显著改变，图2。与癌旁组织相比，胃癌组织中p－ERK蛋白表达量显著升高，见图3。

表1 MiR－219－2－3p表达量与胃癌临床病理参数相关性分析

图2 MGC803细胞中过表达 miR－219－2－3p对细胞中P－ERK水平影响

图3 胃癌组织和癌旁组织中P－ERK水平检测

3 讨 论

miRNA是一类小的非编码RNA分子，由21～23个碱基组成。miRNA在真核基因表达调控中有着广泛的作用，大多数已知的miRNA分子都是和基因的负向调节相关。研究表明，miRNA可作为参与调控基因表达的分子，基于其靶mRNA分子，miRNA可以在肿瘤的发生和发展中起到“促进因子”或是“抑制因子”的作用［10－11］。胃癌中存在多种 miRNA表达的异常，这些miRNA通过对肿瘤相关靶基因的调控发挥作用，在胃癌的发生、发展及其转移等过程中进行分子水平调控，影响胃癌的最终发展和转归［12］。因此，对胃癌中特异的miR－NA进行的研究可为胃癌的临床诊治提供重要的科学理论依据。

本文首先研究了miR－219－2－3p表达水平和胃癌的相关性。首先，运用real－time PCR的方法对胃癌组织及癌旁组织的miR－129－2－3p表达量进行了测定，并通过统计学的方法对不同阶段不同类型的胃癌与miR－219－2－3p表达作了相关性分析，结果表明 miR－219－2－3p水平在晚期胃癌中显著下降。在胃癌细胞系MGC803中过表达miR－219－2－3p后可抑制细胞的增殖速率，提示 miR－219－2－3p可能是一种肿瘤抑制因子。针对上述的实验结果，作者进一步探讨了 miR－219－2－3p可能存在的抑制肿瘤发生发展的机制。已有的研究表明ERK信号通路的激活在多种肿瘤组织中被激活，例如胃癌［13］、胰腺癌［14］、肺癌［15］。而目前在肿瘤细胞系上的相关研究也表明ERK信号通路的激活对肿瘤细胞的转移有着调控作用［16］。为了研究miR－219－2－3p在胃癌中的作用是否与ERK信号通路相关，本研究在胃癌细胞系 MGC803中过表达miR－219－2－3p，结果发现p－ERK表达水平相比于空白对照组与阴性对照组显著地下降，而总的ERK的表达量不变。说明在胃癌细胞系中过表达miR－219－2－3p抑制了ERK信号通路。同时，在胃癌组织样本中，其p－ERK表达水平相对于周围癌旁组织也有显著上升。因此，miR－219－2－3p可能是通过下调ERK信号通路的活性从而产生对胃癌细胞的抑制作用。

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