恒河猴samhd1基因编码区多态性及其对蛋白结构和功能的影响

熊圣文，王 卫，董志会，陈 霆，魏 强

(北京协和医学院比较医学中心，中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

SAMHD1(SAM domain and HD domain 1) 是近年来发现的对HIV-1等逆转录病毒复制具有明显限制作用的天然抗病毒蛋白之一[1,2]，而在恒河猴体内也存在抑制猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)复制的samhd1基因[3]。前期研究表明，Trim5α和Apobec3G等天然抗病毒蛋白在进化过程中，会出现影响抗病毒功能的核苷酸突变；进化分析也证实，samhd1基因部分氨基酸残基位点可能影响Vpx对SAMHD1的敏感性[3]。但有关恒河猴samhd1基因多态性，及对蛋白结构和功能的影响尚未见报道。本研究旨在通过基因测序，序列比对，蛋白质结构预测等技术找到恒河猴Samhd1基因中影响抗SIV功能的cSNP位点，从而为探索SAMHD1抗病毒机制和优化SIV/SHIV/恒河猴模型提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物与样品采集

中国恒河猴138只，购自北京协尔鑫生物资源研究所(合格证编号：SCXK(京)2005-2005)；分别采集动物外周血1 mL，EDTA抗凝，样品采集后4 h内提取RNA。

1.2 外周血RNA的提取及反转录

实验猴EDTA抗凝全血使用RNA blood mini kit(购自Qiagen公司)进行总RNA的提取，提取过程参照试剂盒说明书；提取RNA后立即对其进行反转录。

1.3 RT-PCR扩增

Samhd1基因扩增采用巢式PCR，第一轮RT-PCR使用One Step RNA PCR Kit (AMV)(TaKaRa，大连)进行，操作过程参照试剂盒说明书；第二轮PCR使用KOD-Plus试剂盒(TOYOBO, 上海)进行，操作过程参照试剂盒说明书。Samhd1基因引物由引物设计软件Primer Premier 5.0设计完成，由Invitrogen公司合成。外套引物序列为：outer-F 5′-CCC GAA GGG CTC AAC TGT CA-3′; outer-R 5′-AGA CTT TAA TAA TAC TAA AAA TAG GCA AGG-3′，退火温度为44.5℃。内套引物序列为：inner-F 5′-CAA TAC TGC TTG GAC TCC CCG CC-3′；inner-R 5′-ATT CTA GGA GTG AAG CCC CTA AAT GAA TT-3′，退火温度为51℃。PCR在System 9700 PCR仪上进行(Applied Biosystems公司)。

1.4 序列比对和生物软件分析

DNA测序由北京诺赛基因公司完成。利用DNAstar软件进行核苷酸和氨基酸序列比对[4]，标准恒河猴[Macacamulatta] SAMHD1 cDNA序列为：NM_001271642.1；标准恒河猴[Macacamulatta] SAMHD1氨基酸序列为：NP_001258571。

分别用Predictprotein、SWISS-MODEL软件进行蛋白质二级和三级结构的预测。

1.5 SNaPshot分型检测

SNP的分型检测采用SNaPshot技术，即基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术。该检测过程交由北京阅微基因公司，基于3730XL平台完成。

2 结果

2.1 中国恒河猴Samhd1基因编码区cSNP位点的分布

提取29只恒河猴全血RNA，逆转录PCR后进行测序比对(参照序列为NCBI上公布的Samhd1 cDNA序列，NP_001258571)，一共找到11个突变位点，分别位于基因的N端、SAM结构域、链接区、HD结构域和 C端(表1)；通过使用DNAstar软件进行翻译和氨基酸序列比对，发现其中5个突变位点为非同义突变，在Samhd1编码区上的位置分别是：15 bp (C/G)、 320 bp (C/T)、 547 bp (G/A)、 552 bp (A/T)、839 bp (T/C)[5](图1)。其中G183S、E184D、V280A分布在HD结构域上；S107L分布在SAM结构域上；D5E分布在N端非结构域上。

2.2 非同义cSNP对SAMHD1蛋白二级结构的影响

Predictprotein软件分析结果显示，5个非同义cSNP位点突变影响了SAMHD1蛋白的二级结构，具体的，在264aa位置附近一个α螺旋结构变成β片层，530aa附近增加了一个α螺旋。295aa附近的蛋白质结合位点移动到540aa附近，其它结构均未发生变化(图2，见彩插1)。但当单独出现280aa或 183aa和184aa的突变时，软件分析结果显示并不引起此二级结构变化(图未列出)。

图1 恒河猴SAMHD1的蛋白质结构及SNP分布情况

表1恒河猴samhd1基因突变位点

Tab.1samhd1 nucleotide mutants of the rhesus macaques

结构域突变位点(bp)核苷酸突变氨基酸位置(aa)氨基酸突变N端15C->G5D-E(天冬氨酸-谷氨酸)SAM区168C->T56/320C->T107S-L(丝氨酸-亮氨酸)链接区396C->T 132/528G->A176/HD区547G->A183G-S(甘氨酸-丝氨酸)552A->T184E-D(谷氨酸-天冬氨酸)839T->C280V-A(缬氨酸-丙氨酸)1125A->G375/C端1692C->G 564/1752C->T584/

2.3 非同义cSNP对SAMHD1蛋白功能的影响

为预测cSNP对SAMHD1蛋白功能的影响，使用SWISS-MODEL软件对SAMHD1蛋白不同结构域进行结构预测。

图3A所示samhd1基因SAM结构域的三级结构分析图，绿色标出文献中通过进化分析找到的影响Vpx对SAMHD1敏感性的位点，其中，包括红圈中的S107L位点，说明S107L影响病毒Vpx蛋白对SAMHD1的敏感性。

图3B为samhd1基因HD结构域的三级结构分析图，可以看到G183S、E184D、V280A三个位点均分布在蛋白质表面，且和文献中已知的重要位点(绿色标出)距离较远，其中V280A处于蛋白质活性中心(凹槽部位)的袋口处，类似于盒盖的结构上，可能会影响到SAMHD1的脱氧核苷酸三磷酸水解酶催化活性；而G183S、E184D两个位点均分布在凹槽的背面，但文献中报道的一些可能影响Vpx对SAMHD1敏感性的位点也位于类似位置(如图3B“凹槽”下方的绿色位点)，所以不能排除G183S、E184D两个位点会影响SAMHD1与Vpx结合的可能性(图3见彩插1)。

2.4 基因分型及cSNP位点的频率测定

根据发现的核苷酸有义突变位点，利用SNaPshot技术对138只中国恒河猴进行了基因分型并验证是否为cSNP位点。通过SNaPshot检测，发现138只中国恒河猴中C15G基因频率占2.17%；C320T的基因频率为6.88%；G547A的基因频率为13.41%；A552T的基因频率为4.35%；T839C的基因频率为17.39%，这5个位点均可判定为SNP(基因频率大于1%)。另外还发现G547A和T839C存在较强的连锁关系，连锁频率占21.01%。对基因分型结果进行分析，本实验共找到了6种突变基因型(根据5个cSNP在基因中的前后顺序，将正常基因型表示为：… C…C…GA…T…)，详情见表2。

表2 恒河猴samhd1突变基因型及比率

3 讨论

SAMHD1主要在单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞、树突状细胞等髓系细胞以及静息CD4+T细胞中表达[1]。SAMHD1具有磷酸水解酶活性，受dGTP的调控，它对HIV-1复制的限制是通过降解细胞内dNTP的水平[6,7], 使胞内dNTPs的水平低于病毒复制的需要水平，从而切断HIV-1逆转录所需底物的来源；这一过程被称为“核苷酸仓库耗竭”。 研究发现SAMHD1对HIV-1 的复制具有明显的限制作用，但可以被HIV-2和SIV编码的Vpx蛋白拮抗[2]。另外，有些Vpr蛋白也能起到类似作用[3]。2011年，Powell et al通过功能实验找到了20多个与SAMHD1蛋白功能有关的氨基酸残基位点[8]。2012年，Lim et al通过正向选择分析找到6个氨基酸残基位点可能影响Vpx对SAMHD1的敏感性[3]。因此，氨基酸残基位点的突变对于SAMHD1的抗病毒功能将可能产生很大影响。

非同义cSNP碱基序列的改变可使以其为模板翻译的氨基酸序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。因此，本研究主要分析了SAMHD1分子的编码区非同义SNP位点。

和人类相似，在进化过程中恒河猴SAMHD1分子上也存在着大量的SNP位点。 2012年，Coon et al在分析人samhd1基因多态性时，发现SNP (rs1291142)与SAMHD1表达量显著相关[7]。因此，我们对恒河猴SAMHD1分子的编码区突变情况进行了大样本的筛查，总共有5个位点被鉴定为非同义cSNP，在群体中均占有较高的频率，其中G183S、E184D、V280A分布在具磷酸水解酶活性的HD结构域上；S107L分布在参与蛋白-蛋白或蛋白-RNA 相互作用的SAM结构域上。

为了判断这些cSNP是否能影响到蛋白质的功能，我们先进行了蛋白高级结构和功能预测分析。用软件对SAMHD1二级、三级结构的分析发现，5个cSNP中G183S、E184D、V280A三个位点最有可能影响蛋白质的功能和结构，在二级结构上，这三个位点所处的HD结构域发生了一个α螺旋到β片层的转变，一个蛋白质结合位点也因为这三个cSNP的出现而发生了移位；在三级结构上，V280A正好处于蛋白质活性中心(凹槽部位)的袋口处，类似于盒盖的结构上，可能会影响到SAMHD1的磷酸水解酶催化活性。另外，发现S107L与文献中报道的可能影响病毒Vpx蛋白对SAMHD1敏感性的位点重合，说明此位点也有较大可能会改变蛋白质的功能。D5E未分布于重要的蛋白结构域上，目前还没有能改变蛋白功能的证据支持，但也有文献报道，SAMHD1蛋白的N端能够与艾滋病毒相互作用，所以有待进一步的实验验证。如果实验验证这些位点与抗病毒功能有关，则说明该蛋白与SIV在相互进化过程中发生了选择作用。

这些分析为之后蛋白功能实验提供了大量的参考依据，同时也为SAMHD1抗病毒机制的进一步研究发掘了新的靶点。我们后续还将分别对在SAMHD1上发现的6种基因型进行蛋白功能实验验证。

参考文献：

[1] Baldauf HM, Pan X, Erikson E, et al.SAMHD1 restricts HIV-1 infection in resting CD4(+) T cells [J]. Nat Med, 2012， 18(11):1682-1687.

[2] Laguette N, Sobhian B, Casartelli N, et al.SAMHD1 is the dendritic- and myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx [J]. Nature, 2011. 474(7353):654-657.

[3] Lim ES, Fregoso OI, McCoy CO, et al. The ability of primate lentiviruses to degrade the monocyte restriction factor SAMHD1 preceded the birth of the viral accessory protein Vpx [J]. Cell Host Microbe, 2012， 11(2):194-204.

[4] 刘克剑, 丛喆, 金光, 等. 表现神经症状的SIVmac251感染猴大脑基底节病毒gp120序列变异分析 [J].中国实验动物学报, 2012, 2:37-42.

[5] 李佩璐, 陈倩倩, 张驰宇. 髓系单核细胞来源的 HIV-1 限制性因子—SAMHD1 [J].动物学研究, 2012, 33(5):537-541.

[6] Powell RD, Holland PJ, Hollis T, et al. Aicardi-Goutieres syndrome gene and HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a dGTP-regulated deoxynucleotide triphosphohydrolase [J]. J Biol Chem, 2011， 286(51):43596-43600.

[7] Goldstone DC, Ennis-Adeniran V, Hedden JJ, et al.HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase [J]. Nature, 2011， 480(7377):379-382.

[8] Coon S, Wang D, Wu L. Polymorphisms of the SAMHD1 gene are not associated with the infection and natural control of HIV type 1 in Europeans and African-Americans [J]. AIDS Res Human Retroviruses, 2012, 28(12): 1565-1573.