长爪沙鼠ApoE基因SNPs的遗传多态性

刘月环，王志远，杜江涛，余 强，余陈欢，吴旧生，应华忠

(1.浙江省医学科学院，杭州 310013；2.浙江大学动物科学学院，杭州 310029)

高脂血症及脂肪肝是较常见的疾病，主要是由脂代谢紊乱引起，是导致心脑血管疾病重要的危险因子之一[1]。随着人们生活水平的提高及西方饮食文化的渗入，目前该病的发病率在我国发达地区有时高达50%[2-3]，因此研究该病的发生机制，寻找高效的防治靶点，筛选药物，培育和建立具有自主知识产权的特色动物模型，成为生物医药及实验动物行业一个意义重大的科学课题。

现已知除少数高脂血症(继发性高脂血症)是由于全身性疾病所致外，绝大多数原发性高脂血症是因遗传基因缺陷(或与环境因素相互作用)引起。随着分子生物技术的发展，发现部分高脂血症患者存在单一或多个基因的缺陷，多具有家族聚集性，有明显的遗传倾向，临床上称为家族性高脂血症：家族性高胆固醇血症，如家族性载脂蛋白B100缺陷症；家族性混合型高脂血症；家族性异常β-脂蛋白血症等[4]。现有的研究表明，存在一种或数种基因能决定个体是否发生高脂血症。其次，某些基因可能影响个体对高脂血症的易感性。这些基因可能先天遗传获得，也可能是后天与环境因素的相互作用中由基因突变而形成[5]。最近的研究认为，由于饮食作为一种环境因素与遗传易感性相互作用，在与脂蛋白代谢异常和心血管疾病发生的关键蛋白中，ApoE的影响最大[6]。ApoE蛋白可能对脂蛋白代谢起双向调节作用，其结构变异或ApoE基因多态性可能导致脂蛋白代谢异常[7]。

自上个世纪六十年代以来，国内外学者就高脂饲料诱发的长爪沙鼠高脂血症的研究结果表明，该动物以其成模时间短(只需要四周)、性状典型(与人类高脂血症极为相似)、饲料配方简便(如不需要甲状腺抑制药物)而著称[8-9]。长爪沙鼠高脂血症的表型与人类较为相似，但遗传基础不清。笔者为弄清该表型的遗传原因，从筛选主基因和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)标记，培育高脂血症的新品系出发，通过几年的努力，克隆到了沙鼠的ApoE基因[10]，探明诱发模型组，正常组及8月龄以上自发型性高脂血症组等三类动物该基因CDS区均存在97位(C→T)，781位(G→T)，1774位(A →T)等3个变异位点，这些突变还导致了蛋白质序列中产生了11位(信号肽区)丙氨酸(Ala)到缬氨酸(Val)的突变，65位亮氨酸(leu)到亮氨酸(leu)的突变，256位赖氨酸(Lys)到蛋氨酸(Met)的突变。本研究为验证这三个SNP在两个级别Z：ZCLA封闭群中的分布情况，在对全群遗传概貌进行评价的同时，也评价其作为遗传标记的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物与试剂

实验用长爪沙鼠由浙江省医学科学院实验动物中心提供并饲养(实验动物使用许可证：SCXK(浙)2008-0034，SYXK(浙)2008-0114，商品化饲料参照GB14923-2010生产)。PCR试剂rTaq酶及marker全套试剂购自Takara公司，PCR产物送上海华津和上海英竣公司测序，电泳试剂皆国产分析纯。

1.2 引物设计

表1 筛选SNP所用引物表

1.3 PCR-SSCP反应条件和程序

五对引物的扩增都采用15 μL反应体系，包括：0.4 μL DNA模板，镁离子浓度为0.9 mmol ((P1)；1.5 mmol (P2, P5)；1.2 mmol (P3, P4)，1.2 μL dNTPs(10 mmol/mL)，上下游引物各0.6 μL(10 mM)，0.075 μL (5U/μL) Taq酶。PCR反应条件：94℃预变性4 min，然后循环30次，每一循环包括：94℃变性30 s，59℃(P1, P2, P4, P5)或60℃(P3)解链30 s，然后72℃延伸30 s，循环结束后72℃延伸10 min，最后4℃结束反应。扩增后2.5%的琼脂糖凝胶(含EB染色液)电泳观察并拍照。然后用非变性聚丙烯酰胺凝胶SSCP检测，电泳取5μL PCR产物与5 μL 6× 变性上样缓冲液(98% 甲酰胺、0.025%溴酚蓝、10 mmol/L EDTA(pH8.0)，10%甘油)混匀．置PCR仪中95 ℃变性5 min，迅速放入冰浴中20 min，冷却后点样。采用8%～12%(P1为10%, P2为8%, P3-5为12%)非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺=99:1)，电泳缓冲液为0.5×TBE，180 V电泳1 h 15 min。电泳结束后，取下胶标记方向后放在摇床染槽里进行染色。步骤是：在含9.6%的乙醇和0.5% 的冰醋酸的固定液中固定10 min，去离子水清洗2 min，0.1%的硝酸银中染色10 min，然后去离子水中清洗10 min，在含有1.5% NaOH和0.4%甲醛的显色液中显色，直至条带清晰为止，采用BIO-RAD凝胶成像系统照相保存。

图1 781位点基因型的PCR-SSCP图谱781位(G→T)，泳道4、9为GG型；泳道1、5、7、8、10为GT型；泳道2、3、6为TT型.

1.4 数据统计处理

根据经典的数量遗传学和群体遗传学公式计算如下指标：

等位基因频率(allele frequency)与基因型频率(genotypic frequency)。 按Nei和Roychoudhurg (1974)[11]方法计算位点的杂合度其中H为平均位点杂合度，Pi为第i个等位基因的频率，r为SNP位点数，m为等位基因数)。按Bostein等(1980)[12]方法计算多态信息量(polymorphism information content，PIC)PIC=1-为位点平均多态信息量，r为SNP位点数，Pi，Pj分别为第i个、第j个等位基因的频率，m为等位基因数)。计算有效等位基因数 (effective number of allele，Ne)，其中Pi为第i个等位基因的频率，Ne为平均有效等位基因，r、m同上。以每个个体纯合位点占总检测座位的比率来计算基因纯合度 (individual gene homogeneity)。

2 结果

2.1 突变基因频率、基因型频率分布

利用5对PCR-SSCP引物对ApoE基因的进行了多态性扫描，结果显示P1、P2和P5的PCR产物具有多态性，分别是97位(C→T)、781位(G→T)、1774位(A→T)(图1)。其中P1发现三种基因型(CT、CC、TT)；P2发现三种基因型(GG、GT、TT)，P5只有二种基因型(AT、AA),在检测的群体中没有发现TT基因型个体。对于PCR条带及SSCP聚丙烯酰胺电泳结果不佳者予以剔除，结果列于表2。ApoE基因三个SNP的六个等位基因在两个级别的群体中分布都不平衡，其中群体内发生97位(C→T)的突变，等位基因C的在世代间、微生物控制级别间、性别间及年龄间的频率均达0.95以上，占绝对优势，而杂合子仅在普通环境饲养的49代雌鼠中存在5只，屏障环境中未发现；而在781位(G→T)和 1774位(A→T)的突变则相对均衡，主要原因是杂合子占有相当数量，但1774突变中没有TT型纯合子，781位的杂合子占了绝大多数，相对平衡。

2.2 杂合度、多态信息量、纯合度多态性分析

在本研究群体中，通过考察不同微生物控制级别的两个群体、不同世代、不同性别、不同年龄，我们得到了97位点、781位点和1774位点的平均等位基因为2个(表3)，遗传方式基本符合孟德尔定律；期望杂合度分别是0.063、0.501、0.499，全群平均为0.354；PIC分别是0.061、0375、0.374，全群平均0.270，表明在C97T上属于低度多态，在G781T，A1774T上属于中度多态。

3 讨论

载脂蛋白基因启动子区的 SNPs 单倍型与血浆 TG水平、TC 水平相关已有较多报道[13]，ApoC3 上游区 -482T/C 多态性、ApoA5 上游区 -1131T/C、-3A/G多态性与 TG 水平强相关[14-5]；Pullinger 等[16]证实了 ApoA5 基因553G>T(rs2075291)对美国的中国血统和非中国血统的人种血浆 TG代谢的影响。Chien 等[17]发现ApoA1-75G>A、ApoA1 83C>T、ApoC3 3175C>G、ApoC3 3206G>T、ApoA4 127A>G 和 ApoA5 553G>T 与高TG的关系发现，在中国人群中，这些多态性位点及其单倍型与HTG/HDL 的比值有关系。Ribalta等[18]发现 ApoC3 基因第 3 外显子 -1100-T/A 多态位点与家族性混合型高脂血症患者 VLDL 和 IDL 颗粒的数目的增多有关。

ApoE蛋白在人上已发现了三种变异体，分别与人高脂血症及动脉粥样硬化易感性相关[19]，已在各国各人种上有相当多的报道[20-21]，国内也有多个民族多个地区的报道[22-23]。关于该基因的SNP报道也有在内含子区发现有调节基因表达的序列[24]，ApoE基因型与ApoC3 基因 -482C>T、-455T>C 和3238C>G 多态性及与血浆脂类的参数的关联关系[25]。而在猪上也已发现了7个SNP[26]，启动子区也发现了一个可以调节ApoE基因起始转录的SNP[27]，但其多态性和碱基突变与编码蛋白构象及功能的关系，除了人外，大小鼠尚无报道。

表2 三个SNP的基因型频率和等位基因频率

表3 两种饲养环境下长爪沙鼠群体在三个SNP位点上的杂合度和PIC

x2是检测哈迪温伯格平衡，*表示P< 0.05，**表示P< 0.01，表示两个位点上全群都未达哈迪温伯格平衡。

Chi-square was used to detect Hardy-Weinberg balance,** presented that the Chi-square was significant at 0.01 level.

P1, 2和5的PCR产物具有多态性,其中P1发现三种基因型(CT、CC、TT)；P2发现三种基因型(GG、GT、TT)，P5只有二种基因型(AT、AA),这些突变导致了蛋白质序列中产生了11位(信号肽区)丙氨酸(Ala)到缬氨酸(Val)的突变，65位亮氨酸(leu)到亮氨酸(leu)的突变，256位赖氨酸(Lys)到蛋氨酸(Met)的突变，三个突变并未导致氨基酸极性的改变，由此认为，突变后的氨基酸对编码蛋白可能无影响，但需要进一步验证。

Z:ZCLA长爪沙鼠ApoE基因在群体内发生97位(C→T)突变，等位基因C的在世代间、微生物控制级别间、性别间及年龄间的频率均达0.95以上，占绝对优势，主要原因是杂合子过少，而杂合子仅在普通环境饲养的49代雌鼠中存在5只，屏障环境中未发现；而在781位(G→T)，1774位(A→T)的突变则相对均衡，主要原因是杂合子占有相当数量，但1774突变中没有TT型纯合子，笔者以为可能是纯合致死或检测的群体有效含量不够大，781位的杂合子占了绝大多数，导致ApoE基因频率和基因型分布不平衡，这些是否跟保种的选择及生活适应能力的大小有关，有待于进一步研究。根据ApoE基因各等位基因在全群中的分布频率及PIC值得出全群目前在中度多态，这或许与该群体封闭繁育了30多年有关。根据三个SNP在各个世代中的分布情况推断，这三个SNP遗传符合孟德尔定律，具备作为遗传标记的基础，进一步对其进行遗传力的评估后决定是否可用于选种。

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