90K/Mac-2BP基因沉默增强HIV-1 感染的单核巨噬细胞凋亡

傅春燕，蒋 虹，薛 婧，丛 喆，陈 霆，魏 强

(北京协和医学院比较医学中心，中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

艾滋病严重危害着人类的健康与生命。尽管在艾滋病防治的研究与实践上已取得重大进展，但现有的药物无法彻底治愈艾滋病，感染者仍需终身用药，一旦停药，体内的艾滋病毒载量将会快速反弹。造成停药后体内艾滋病毒量快速反弹的重要原因是抗病毒治疗不能完全清除艾滋病毒。一是由于抗病毒药物较难进入病毒感染的细胞，二是由于病毒在一些细胞中能持久潜伏或行低度隐性复制。人们将病毒感染后不发生凋亡、病毒能在其内潜伏并在合适条件下复制的细胞称为艾滋病毒潜伏感染靶细胞，而单核巨噬细胞是一类重要的潜伏感染靶细胞。因此，寻找清除艾滋病毒潜伏感染靶细胞的药物及措施，是艾滋病防治研究的一个重要领域[1-2]。

巨细胞-2结合蛋白(也称Galectin-3结合蛋白，90K/Mac-2BP)在人单核巨噬细胞中高表达，其能与半乳糖凝集素相互作用，发挥多种生物学效应[3-7]。其中最显著的作用是与其受体结合介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质的相互作用[5, 8]。有研究表明淋巴瘤与90K/Mac-2BP 的粘附能够抵抗化疗诱导的细胞凋亡[9]。鉴于文献报道90K/Mac-2BP能与Galectin-3相互作用[5, 10]，并具有一定的抗凋亡作用，我们对90K/Mac-2BP的表达水平是否能调节HIV-1感染单核巨噬细胞的凋亡进行了初步探索，这将为清除HIV-1潜伏感染靶细胞提供初步依据。

1 材料和方法

1.1 试剂及细胞

人单核巨噬细胞株U937(北京协和医学院基础研究所细胞中心)。PE-Annexin V/ PerCP-7-AAD凋亡检测试剂盒(BD Pharmingen公司)。以90K/Mac-2BP为靶基因的3个siRNA(Origene 公司)，序列为：A-rArGrCrGrCrUrCrArGrCrUrUrCrArArGrArArAr UrUrArCTG；B-rArCrCrUrCrArCrCrGrArGrGrArUrAr CrCrUrArCrArArGCC；C-rArGrArCrGrUrCrArCrCrGr ArUrUrUrCrGrArGrGrGrCrUGG。小鼠抗人90K/Mac-2BP单克隆抗体(Origene公司)。HIV-1全长质粒(Clone:11739，R5 tropic)(NIH 提供)。转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司)。细胞RNA提取试剂盒(QIAGEN公司)。cDNA合成试剂盒、SYBR GREEN I荧光实时定量试剂盒(TAKARA公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

U937细胞于5%CO2、37℃细胞培养箱中培养。培养基为改良型RPMI-1640培养液(加入10%胎牛血清、200 U/mL青霉素、200 μg/mL链霉素)。处于对数生长期的细胞用于本实验。

1.2.2 HIV-1病毒的制备

以NIH来源的HIV-1全长质粒(Clone:11739，R5 tropic)采用阳离子脂质体方法转染293T细胞，12 h后更换新鲜培养基，72 h后收获HIV-1病毒悬液。

1.2.3 HIV-1病毒感染U937细胞

将含有HIV-1的病毒悬液加入到U937细胞的培养基内，培养4～5 d后收集细胞；将收集的细胞用PE-AnnexinV和PerCP-7-AAD染色，流式细胞术检测细胞凋亡[11-12]。

1.2.4 细胞凋亡的检测

细胞凋亡的检测利用PE-Annexin V/ PerCP-7-AAD凋亡检测试剂盒[11-12](BD Pharmingen公司)，操作步骤参照试剂盒说明书。收集5×105个细胞于流式管中，冰预冷的PBS洗两次，1×Annexin V Binding Buffer洗一次，弃上清后，轻轻弹起细胞，分别加入5 μL PE-Annexin V、5 μL PerCP-7-AAD，室温下避光孵育15 min。加入300 μL 1×Annexin V Binding Buffer，在1 h内流式细胞仪(FACS Canto；BD)检测细胞凋亡情况。

1.2.5 90 K/Mac-2BP 基因沉默

将以90K/Mac-2BP为靶基因的siRNA利用阳离子脂质体方法转染U937细胞，6 h后更换新鲜培养基，48 h后检测基因沉默情况。

1.2.6 细胞RNA的提取和反转录

收获细胞并用细胞RNA提取试剂盒(QIAGEN)进行总RNA提取，提取过程参照试剂盒说明书。使用分光光度计(NanoDrop 2000c，Thermo Scientific)检测RNA的浓度和质量。提取RNA后立即对其进行反转录操作。反转录使用Prime Scrip 试剂盒(TAKARA)进行，操作过程参照试剂盒说明书。反转录获得的cDNA于-20℃储存备用。

1.2.7 利用荧光定量PCR检测RNA的表达水平

根据GenBank上人90K/Mac-2BP和GAPDH序列，利用引物设计软件Primer Premier 5.0进行人基因90K/Mac-2BP和GAPDH的引物设计。引物由Invitrogen公司合成。引物序列为：90K/Mac-2BP-F AACCCAAGGCGTGAACGATG；90K/Mac-2BP-RCTG GGTGGCGTTCTCGAAGC；GAPDH-FCTCCTGTTCGA CAGTCAGCC；GAPDH-RACCAAATCCGTTGACTCC GAC。退火温度为60℃。所有样本的荧光定量PCR检测获得的CT值数据后，利用ΔΔCT法计算各样品基于内参基因的相对表达含量。

1.2.8 90 K/Mac-2BP蛋白表达的检测

利用western blotting免疫印记法检测。收集5×106个细胞，PBS洗一次，加入100 μL RIPA裂解液，冰浴30 min，13000 r/min 4℃离心30 min，取上清液。在酶标仪上用BCA法参照标准蛋白浓度，于562 nm处测定样品的吸光值。根据蛋白定量的标准曲线计算各样本的蛋白含量。

配制10%分离胶和5%积层胶，取80 μg蛋白样品溶于相应体积的上样缓冲液中，98℃煮沸5 min，蛋白变性后即可加样。室温下80 V电泳30 min，蛋白样品到达分离胶后将电压调为120 V，继续电泳约1 h。配制电转液，冰浴中300 mA电转约1 h。将电转后的NC膜置于5%脱脂牛奶中室温封闭1 h。随后将膜放入一抗中4℃孵育过夜。第2天将膜置于TBST中清洗3次，每次10 min，再置入二抗中室温孵育1 h。抗体如下稀释：抗90K/Mac-2BP(1∶500)、抗β-actin(1∶15000)、HRP标记山羊抗小鼠(1∶20000)。与二抗反应后，将膜置于ECL发光液中3 min，放入化学发光分析仪进行检测。结果用ImageJ 软件分析蛋白条带的相对密度。

1.2.9 统计分析

数据用GraphPad软件分析，以均值±标准差表示。用Student's t-test对数据作统计处理，P< 0.05具有显著性差异。

2 结果

2.1 利用荧光定量PCR检测U937细胞90K/Mac-2BP mRNA的表达

利用siRNA基因沉默技术，将U937细胞中的90K/Mac-2BP基因沉默，然后提取细胞RNA并进行反转录，利用荧光定量PCR技术，在RNA水平检测基因沉默效果。图1为荧光定量PCR检测获得的CT值，利用ΔΔCT法，即2-ΔΔCT计算得到的各样本基于内参基因GAPDH的相对表达含量。结果显示U937细胞转染siRNA A后，在RNA水平90K/Mac-2BP基因的表达含量相比对照组下降了89.33%，其次为B下降了84.33%， C下降了48.00%。

注：与对照相比，*P < 0.05。

2.2 western blotting检测U937细胞90K/Mac-2BP蛋白的表达

利用siRNA基因沉默技术，将U937细胞中的90K/Mac-2BP基因沉默。我们将针对90K/Mac-2BP基因的siRNA转染至U937细胞，利用western blotting技术，检测90K/Mac-2BP基因在siRNA转染前后蛋白水平的表达情况。图2A观察到在内参β-actin基本表达一致的情况下，90K/Mac-2BP基因siRNA转染后的U937细胞(A、B、C)的条带相比对照条带浅，说明90K/Mac-2BP达到了一定的沉默效果，其中A的沉默效果最为明显。图2B为western blotting的定量分析结果，结果表明与siRNA转染前对照细胞相比，转染A的U937细胞中90K/Mac-2BP的表达水平下降了59.62%，转染B的U937细胞中90K/Mac-2BP的表达水平下降了40.38%，转染C的U937细胞中90K/Mac-2BP的表达水平下降了34.38%。

注：与对照相比，*P < 0.05。

2.3 HIV-1感染90K/Mac-2BP 基因沉默的U937细胞凋亡增加

注：与对照相比，*P < 0.05。

Annexin V阳性代表发生凋亡的细胞。图3A显示90K/Mac-2BP基因沉默的U937细胞与对照U937细胞(8.03±0.25)%相比，凋亡率并没有增加，分别为：(7.74±0.22)%，(9.07±0.47)%，(8.04±0.34)%，其与对照均无显著差异，说明90K/Mac-2BP基因沉默对U937细胞本身的凋亡无影响。图3B显示正常的人单核巨噬细胞株U937，经HIV-1感染后细胞凋亡率为(16.27±0.30)%，而90K/Mac-2BP基因沉默的U937，经HIV-1感染后，细胞凋亡率分别增加至(31.62±0.35)%，(25.76±0.30)%，(23.69±0.34)%。图3C结果显示90K/Mac-2BP 基因沉默的U937细胞比正常的U937细胞经HIV-1感染后的凋亡率明显增加(p﹤0.05)，说明90K/Mac-2BP的表达水平能够调节HIV-1感染人单核巨噬细胞的凋亡，即90K/Mac-2BP表达量降低，HIV-1感染人单核巨噬细胞凋亡率升高。

3 讨论

90K/Mac-2BP最初作为肿瘤相关抗原在人乳腺癌细胞培养上清中被检测出来[13]，它由90×103的亚基组成，故名90K，并且它是半乳糖凝集素3(Galectin-3)的配体之一，由多种细胞合成分泌，其中包括造血细胞、上皮细胞等。90K的作用目前还没有完全阐明，研究表明它可以增加杀伤细胞的活性、促进细胞因子的产生、肿瘤增长的抑制等，另外，在黑色素瘤中的研究表明，它可以通过与细胞表面Galectin-3的相互作用，增加细胞间的粘附[10]。通常情况下，正常人血清中90K/Mac-2BP的含量在μg/mL的范围内，研究表明，血清中90K的高水平表达与某些肿瘤细胞的发生、增殖、分化和转移有关[14]。文献报道90K/Mac-2BP对于前列腺癌的诊断具有重要作用。另外，有研究报道，在HIV感染的病人中，血清中90K/Mac-2BP的表达增加[6]。然而，对于90K/Mac-2BP在HIV感染的过程中起到何种作用，尚未见有研究报道。

研究报道，HIV感染可使单核巨噬细胞抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-XL的表达增强，基因沉默Mcl-1、Bcl-XL等抗凋亡基因可以增强HIV感染的单核巨噬细胞发生凋亡[12]。本研究观察到利用siRNA 基因沉默技术，使90K/Mac-2BP表达量降低后，HIV-1诱导单核巨噬细胞凋亡率明显升高，提示了90K/Mac-2BP与HIV-1感染后单核巨噬细胞的抗凋亡能力有一定的关系。但其作用机制是否与调节促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白的表达相关，仍需进一步研究证实。鉴于Galectin-3作为90K/Mac-2BP的受体且具有抑制细胞凋亡的作用[15]，尽管尚未有报道，可以设想HIV-1感染单核巨噬细胞中的90K/Mac-2BP有可能通过与Galectin-3相结合而发挥作用。这个现象提示90K/Mac-2BP可能作为清除艾滋病毒潜伏感染单核巨噬细胞的一个值得深入研究的候选者。

参考文献：

[1] Eisele E, Siliciano RF. Redefining the viral reservoirs that prevent HIV-1 eradication[J]. Immunity, 2012, 37(3):77-388.

[2] Vinuesa CG. HIV and T follicular helper cells: a dangerous relationship[J]. The Journal of clinical investigation, 2012, 122(9):3059-3062.

[3] Tinari N, Kuwabara I, Huflejt ME,etal. Glycoprotein 90K/MAC-2BP interacts with galectin-1 and mediates galectin-1-induced cell aggregation[J]. International journal of cancer, 2001, 91(2):167-172.

[4] Ozaki Y, Kontani K, Teramoto K,etal. Identification of antigenic epitopes recognized by Mac-2 binding protein-specific cytotoxic T lymphocytes for use in cancer immunotherapy[J]. Biochemical and biophysical research communications, 2004, 317(4):1089-1095.

[5] Kim SJ, Lee SJ, Sung HJ,etal. Increased serum 90K and Galectin-3 expression are associated with advanced stage and a worse prognosis in diffuse large B-cell lymphomas[J]. Acta haematologica, 2008, 120(4):211-216.

[6] Ullrich A, Sures I, D'Egidio M,etal. The secreted tumor-associated antigen 90K is a potent immune stimulator[J]. The Journal of biological chemistry, 1994, 269(28):18401-18407.

[7] Darcissac EC, Vidal V, De La Tribonniere X,etal. Variations in serum IL-7 and 90K/Mac-2 binding protein (Mac-2 BP) levels analysed in cohorts of HIV-1 patients and correlated with clinical changes following antiretroviral therapy[J]. Clinical and experimental immunology, 2001, 126(2):287-294.

[8] Marchetti A, Tinari N, Buttitta F,etal. Expression of 90K (Mac-2 BP) correlates with distant metastasis and predicts survival in stage I non-small cell lung cancer patients[J]. Cancer research, 2002, 62(9):2535-2539.

[9] Fornarini B, Ambrosio CD, Natoli C,etal. Adhesion to 90K (Mac-2 BP) as a mechanism for lymphoma drug resistance in vivo[J]. Blood, 2000, 96(9):3282-3285.

[10] Inohara H, Akahani S, Koths K,etal. Interactions between galectin-3 and Mac-2-binding protein mediate cell-cell adhesion[J]. Cancer research, 1996, 56(19):4530-4534.

[11] Laforge M, Campillo-Gimenez L, Monceaux V,etal. HIV/SIV infection primes monocytes and dendritic cells for apoptosis[J]. PLoS pathogens, 2011, 7(6):e1002087.

[12] Busca A, Saxena M, Kumar A. Critical role for antiapoptotic Bcl-xL and Mcl-1 in human macrophage survival and cellular IAP1/2 (cIAP1/2) in resistance to HIV-Vpr-induced apoptosis[J]. The Journal of biological chemistry, 2012, 287(18):15118-15133.

[13] Iacobelli S, Arno E, D'Orazio A,etal. Detection of antigens recognized by a novel monoclonal antibody in tissue and serum from patients with breast cancer[J]. Cancer research, 1986, 46(6):3005-3010.

[14] Hu J, He J, Kuang Y,etal. Expression and significance of 90K/Mac-2BP in prostate cancer[J]. Experimental and therapeutic medicine, 2013, 5(1):181-184.

[15] Yang H, Lei C, Cheng C,etal. The antiapoptotic effect of galectin-3 in human endometrial cells under the regulation of estrogen and progesterone[J]. Biology of reproduction, 2012, 87(2):39.