NOD/SCID小鼠主要脏器重量、血生理生化指标和免疫细胞的测定

王怀远，吴旭颖，张文明，田玉书，吴金峰，王 宇，张亚静，杨志伟

(北京华阜康生物科技股份有限公司，北京，102200)

非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠是由Jackson实验室用NOD/Lt鼠与C.B-17-scid鼠杂交获得的[1]。NOD/SCID小鼠除保有C.B-17-scid鼠T、B淋巴细胞缺陷的特性外,还具有NK细胞活性低、无补体溶血活性、巨噬细胞功能下降、渗漏现象少、不能发生自发免疫性糖尿病等特点[2]。NOD/SCID小鼠常用于肿瘤研究、糖尿病和肥胖研究、免疫学研究、胚胎干细胞研究、艾滋病及肝炎研究，为T、B、NK细胞缺陷的严重联合免疫缺陷动物模型。NOD/SCID小鼠自Jackson实验室引入国内后，经过多代繁殖，同时饲养环境、营养水平等方面也发生了一定的改变，小鼠的遗传性状、生理生化等生物学特征需进一步进行验证和探讨。因此我们对本公司NOD/SCID小鼠的主要脏器重量、血液生理生化指标和免疫功能等进行了测定，为利用该品系进行生物医药方面研究提供基础的生物学资料。

1 材料和方法

1.1 动物来源

实验所需SPF级NOD/SCID小鼠5、10周龄各24只(雌雄各半)，共计48只，免疫功能检测所需6周龄的NOD/SCID小鼠4只，雌雄各2只，均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，生产许可证号为：SCXK(京)2009-0004。

1.2 饲养管理及环境

实验用NOD/SCID小鼠均饲养在北京华阜康生物科技股份有限公司SPF车间的隔离器内，隔离器内的洁净度为5级标准，温度控制在24±2℃，相对湿度50%±10%，换气次数每小时为20次，明暗照明周期为12 h:12 h，动物自由采食与饮水。

实验用饲料为北京华阜康生物科技股份有限公司生产的辐照灭菌的60Co鼠繁殖料1035(SCXK(京)2009-0008)。主要营养指标为：粗蛋白23.82%、粗脂肪5.16%、粗灰分7.19%、粗纤维4.62%、水分8.81%、钙1.25%、磷0.97%、赖氨酸1.55%、蛋氨酸+胱氨酸0.91%。饮用水为酸化过滤自来水(ph=2.7～3.0)并经121℃、30 min高压蒸汽灭菌。使用的垫料等经过132℃、30 min高压蒸汽灭菌，每周更换一次垫料，进出隔离器的物品均进行消毒处理，严格遵守隔离系统操作规程。

实验环境为中国医学科学院医学实验动物研究所解剖实验室，实验室使用许可证号：SYXK(京)2013-0019。

1.3 仪器及试剂

法国ABX Pentra DX 120血细胞分析仪和配套试剂、日立7100全自动生化分析仪和配套试剂、美国贝克曼Allegra 64R台式高速冷冻离心机、美国BD公司流式细胞仪(FACS)、红细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)。

1.4 实验方法

1.4.1 体重和脏器质量的测定：实验前禁食12 h，禁水1 h，用电子天平称取5、10周龄小鼠体重，眼眶采血后脱颈椎处死，立即剖取脾脏、肝脏、肾脏、心脏、肺脏、脑，并用滤纸吸干组织表面的水分，称取质量。

1.4.2 血生理指标测定：从小鼠眼眶后静脉丛采血，取0.2 mL血液到EDTA2k抗凝管内，进行血生理测定。12项血生理指标为：血红蛋白(HGB)、红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、淋巴细胞(LYM)、血小板(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PCT)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布宽度(RDW)。

1.4.3 血生化指标测定：将剩余的全血取0.8 mL到离心管内，3000 r/min，离心10 min后取血清，进行血生化测定。15项血清生化指标为：总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、总胆红素(TBIL)、尿素氮(UN)、肌酐(CREA)、血钙(Ca)、无机璘(P)。

1.4.4 免疫功能检测方法：采用小鼠摘眼球取血法取300 uL外周血，经红细胞裂解液去除红细胞后，将细胞用1% BSA/PBS洗两次后分为两管备用。其中一管用PerCP-Cy5.5-CD3、APC-Cy7-CD4、FITC-CD8和PE-Cy7-NK1.1染色30 min，另一管用PerCP-Cy5.5-CD3、FITC-B220和APC-Cy7-CD11b染色30 min，洗后用流式细胞仪(FACS，Aria)检测并用FCS Express V3.0软件分析数据。免疫细胞测定：T细胞(CD3+、CD4+、CD8+)、B细胞(CD19+、B220+)、NK细胞(NK1.1+)、粒细胞(CD11b+)。

1.5 结果处理

实验数据用软件SPSS 19.0进行单因素方差分析，数值以平均值±标准差表示，显著水平为P< 0.05。

2 结果

2.1 NOD/SCID小鼠脏器质量测定结果

表1可见，同周龄NOD/SCID雌鼠的体重比雄鼠小。10周龄雌鼠的双肾、肝脏和肺脏重量低于雄鼠。不同周龄的同性别NOD/SCID小鼠相比，5周龄小鼠的双肾、肝脏、心脏和肺脏重量小于10周龄小鼠。脾脏的重量自5周龄后不随周龄的增长而增大，雌雄之间也无显著差异。

2.2 NOD/SCID小鼠血生理测定结果

NOD/SCID小鼠血生理指标测定结果如表2所示。5周龄雌鼠的HGB、RBC和HCT高于雄鼠。10周龄雌鼠的MCHC和MPV值高于雄鼠，HCT值低于雄鼠。同性别NOD/SCID小鼠相比，10周龄的RBC、HGB和HCT高于5周龄小鼠，而MCV、MCH和RDW低于5周龄小鼠。同周龄的异性间，WBC、MCV、MCH、RDW、PLT、PCT和LYM均无显著差异。

2.3 NOD/SCID小鼠血生化测定结果

表3的血生化结果显示，5周龄NOD/SCID小鼠雌性的A/G、GLU和UN高于雄性，而TP、GLOB、ALP、CHO、TG和TBIL低于雄性。10周龄NOD/SCID小鼠雌性的A/G、ALP和TG高于雄性，GLOB、AST、CHO、TBIL、UN和P低于雄性。同性别NOD/SCID小鼠相比，5周龄的TP、ALB和TBIL低于10周龄小鼠，而ALP和CHO高于10周龄小鼠。同周龄的异性间，ALB、ALT、CREA和Ca无显著差异。

表1 NOD/SCID小鼠脏器重量(单位：g)

表2 NOD/SCID小鼠血生理指标

表3 NOD/SCID小鼠血生化指标

图1 NOD/SCID小鼠外周血免疫细胞百分比

2.4 NOD/SCID小鼠免疫细胞测定结果

图1为一只NOD/SCID小鼠外周血中T细胞及其亚群、B细胞、NK细胞和粒细胞的百分比。由图2可知，NOD/SCID小鼠无T细胞(0.37±0.26)%、CD4+T细胞(0.35±0.13)%、CD8+T细胞(0.47±0.10)%、CD19+ B细胞(0.13±0.05)%、B220+ B细胞(1.20±0.44)%)，有低水平NK细胞(6.90±0.82)%，粒细胞比例为(47.88±15.54)%。

3 讨论

体重和脏器质量是最基本的生物学特征，是衡量NOD/SCID小鼠生长状况的最直观的数据。NOD/SCID小鼠6～7周龄时达到性成熟，9～10周龄左右时达到体成熟，本研究选择5周龄和10周龄两个阶段的NOD/SCID小鼠进行对比研究[3]。本研究发现不同周龄和性别的NOD/SCID小鼠体重的有显著性差异，不同周龄的同性别NOD/SCID小鼠的双肾、肝脏、心脏和肺脏重量也存在差异。5、10周龄的NOD/SCID小鼠与Jackson实验室[4]、Charles River公司[5]的NOD/SCID小鼠相比体重稍轻。

图2 NOD/SCID小鼠免疫细胞百分比

不同周龄的同性别NOD/SCID小鼠的血生理指标RBC、HGB、HCT、MCV、MCH和RDW，血生化指标TP、ALB、ALP、CHO和TBIL具有显著差异；同周龄的雌雄相比，血生理指标HCT有显著差异，血生化指标GLOB、A/G、CHO、TG、TBIL和UN有显著差异。这些差异提示研究人员，在进行相关研究时需要考虑到周龄和性别对于相应数据的影响，以便获得更加严谨可靠的实验结果。与Charles River公司公布的2011年1月至12月的8～10周龄NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠数据相比，血生理指标无显著差异；血生化指标AST数值稍高，GLU、CHO、TBIL和CREA数值稍低[6]。AST数值的测定容易受到众多因素的影响，如样品放置时间[7]、检测仪器与方法等，故AST数值波动范围较大。GLU和CHO数值偏低可能与动物营养有关。TBIL主要来源于衰老红细胞降解后产生出来的血红蛋白，而与Charles River公司的小鼠相比MCV、MCH和MCHC数值很接近，因此TBIL数值偏低与贫血无关。CREA是肌肉代谢的产物，与肌肉总量密切相关，偏低可能与本公司NOD/SCID小鼠体重相对较轻有关。

NOD/SCID小鼠作为T、B、NK细胞缺陷的严重联合免疫缺陷动物模型，被广泛用于肿瘤、糖尿病和免疫学等研究。NOD/SCID小鼠在2～3周龄时离乳，故本研究选择6周龄NOD/SCID小鼠进行免疫细胞的测定，能反映出其免疫细胞的真实水平。本研究证实了NOD/SCID小鼠为T、B、NK细胞缺陷，尽管如此，通过流式细胞术仍能检测出一定量的残存NK细胞活性。这与Shultz[8]报道的结果一致，NOD/SCID小鼠內源的和poly I:C诱导的NK细胞活性均远低于C.B-17-scid鼠，是一种更易于异种移植成功的动物模型。

参考文献：

[1] Prochazka M, Gaskins H R, Shultz L D,etal. The nonobese diabetic SCID mouse : model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992,89(8): 3290-3294.

[2] 孙冰,吴世凯,宋三泰. NOD/SCID小鼠平台上的肿瘤实验研究进展[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2008, 15(4): 307-310.

[3] 李厚达.实验动物学(2)[M], 中国农业出版社, 2003: 100-103.

[4] http://jaxmice.jax.org/strain/001303.html.

[5] http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/nod-scid-mouse#widgetTab1.

[6] http://www.criver.com/files/pdfs/rms/nod-scid/rm_rm_r_nod_scid_mouse_clinical_pathology_data.aspx.

[7] 高建忠. 血液样本放置时间对血常规及生化检测的影响研究[J]. 当代医学, 2013, 19(35): 90-91.

[8] Shultz L D, Schweitzer P A, Christianson S W,etal. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice[J]. J Immunol, 1995, 154(1):180-191.