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Rag2敲除小鼠脏器重量、血液生理生化指标及免疫细胞的研究

2014-08-14吴旭颖魏诏盛吴金峰刘会真田玉书张文明杨志伟

中国比较医学杂志 2014年5期
关键词:脏器周龄生理

王 宇,吴旭颖,魏诏盛,吴金峰,刘会真,田玉书,张文明,杨志伟

(北京华阜康生物科技股份有限公司,北京 102200)

Rag2是由白细胞介素4与costimuli(脂多糖等细胞因子)结合后表达于成熟小鼠B细胞,Rag2基因长度大约18 kb,在V(D)J基因重排和淋巴系细胞发育中的关键性作用[1-4]。Rag2 KO小鼠的表现型是严重的T/B细胞早期发育阻滞,T细胞停滞于CD3-CD4-CD8-CD25+阶段,而B细胞停滞于B220- CD43+IgM- B细胞阶段。它们的外周血没有成熟的循环T/B淋巴细胞,这与人重症联合免疫缺陷综合征SCID非常相似,并且都有V(D)J基因重排缺陷。

纯合的Rag2 KO小鼠是整个Rag2蛋白编码区缺失。但是,该小鼠可以生长繁殖。Rag2突变小鼠具有第三外显子目标基因的缺失。美国The Jackson Laboratory公司描述了纯合的Rag2 KO小鼠、Rag2第三外显子突变小鼠以及Rag2第三外显子未发生突变的小鼠具有同样的表型。鉴于该小鼠的这种表型,可用于免疫学、血液学、肿瘤、炎症反应等多领域的生命科学研究。

该小鼠自国外引进以来,饲养条件与国外发生了一定的变化,但是,我国还没有关于该小鼠系统的基础生理生化参数的研究和报道,本研究拟对Rag2 KO小鼠的脏器重量、血液生理生化指标及免疫细胞进行测定,为我国科研人员利用该小鼠进行生命科学研究和生物医药研发提供基础参考资料。

1 材料和方法

1.1 实验动物

取SPF级Rag2 KO小鼠5、10周龄各24只,雌、雄比例1:1,共计48只,用于脏器和血生理生化检测;取6周龄的Rag2 KO小鼠4只,雌、雄比例1:1,用于免疫细胞检测。所有动物均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,生产许可证号为:SCXK(京)2009-0004。

1.2 饲养环境

Rag2 KO小鼠均饲养在符合国家相关标准的隔离环境内,隔离环境的洁净度标准为5级,温度控制为22℃~26℃,相对湿度为40%~70%,每小时换气20次,明暗周期为12 h:12 h,动物自由采食和饮水。

所用饮水、垫料均经高压灭菌,饲料为自行配制加工的全价颗粒繁殖饲料并经60Co照射灭菌,该产品为北京华阜康生物科技股份有限公司生产,产品编号为小鼠繁殖饲料1035,生产许可证号为:SCXK(京)2009-0008。营养成分为:粗蛋白≥23.0%、粗脂肪≥5.0%、粗灰分≤7.0%、粗纤维≤5.0%、水份≤10%、钙1.4%~1.5%、磷1.0%~1.1%、赖氨酸≥1.32%、蛋氨酸+胱氨酸≥0.78%。水为酸化过滤自来水(ph=2.7~3.0)并经121℃ 30 min高压蒸汽灭菌,使用的垫料等物品均经过132℃ 30 min高压蒸汽灭菌,每周更换1次垫料,饲料和水自由摄取。每周更换1次垫料,进出隔离环境的物品进行严格消毒,并严格遵守隔离系统动物实验室标准操作及管理规程。

1.3 实验环境

动物实验于中国医学科学院实验动物研究所解剖实验室,实验动物使用许可证号为:SYXK(京)2013-0019。

1.4 仪器及试剂

法国ABX Pentra DX 120血细胞分析仪和配套试剂、日立7100全自动生化分析仪和配套试剂、美国贝克曼Allegra 64R台式高速冷冻离心机、美国BD公司流式细胞仪(FACS)、红细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)。

1.5 实验方法

1.5.1 体重和脏器重量的测定:实验前禁食12 h,禁水1 h,用电子天平称取5、10周龄小鼠体重,眼眶采血后脱颈椎处死,立即剖取脾脏、肝脏、肾脏、心脏、肺脏、脑,并用滤纸吸干组织表面的水分,称取重量。

1.5.2 血生化指标测定:将剩余的全血取0.8 mL到离心管内,3000 r/min,离心10 min后取血清,进行血生化测定。15项血清生化指标为:总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、白蛋白/球蛋白(A/G)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、总胆红素(TBIL)、尿素(UN)、肌酐(CREA)、无机璘(P)、血钙(Ca)。

1.5.3 血生理指标测定:从小鼠眼眶后静脉丛采血,取0.2 mL血液到EDTA2k抗凝管内,进行血生理测定。12项血生理指标为:血红蛋白(HGB)、红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、淋巴细胞%(LYM%)、血小板(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PCT)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布宽度(RDW)。

1.5.4 免疫细胞检测方法:采用小鼠摘眼球取血法取300 uL外周血,经红细胞裂解液去除红细胞后,将细胞用1% BSA/PBS洗两次后分为两管备用。其中一管用PerCP-Cy5.5-CD3、APC-Cy7-CD4、FITC-CD8和PE-Cy7-NK1.1染色30 min,另一管用PerCP-Cy5.5-CD3、FITC-B220和APC-Cy7-CD11b染色30 min,洗后用流式细胞仪(FACS,Aria)检测并用FCS Express V3.0软件分析数据。免疫细胞测定:T细胞(CD3+、CD4+、CD8+)、B细胞(CD19+、B220+)、NK细胞(NK1.1+)、粒细胞(CD11b+)。

1.6 统计学处理

采用SPSS19.0软件进行单因素方差统计分析,以平均值±标准差(x±S)表示,显著水平为P< 0.05。

2 结果

2.1 Rag2 KO小鼠脏器检测结果

表1可见,同周龄的Rag2 KO小鼠相比,雄性小鼠心脏、双肾脏、肝脏、脾脏重量高于雌鼠(P< 0.05);同性别的Rag2 KO小鼠相比,10周小鼠脑、肺脏、脾脏、肝脏、心脏、双肾脏重量高于5周小鼠(P< 0.05)。

2.2 Rag2 KO小鼠血液生化检测结果

由表2可见,同周龄的Rag2 KO小鼠相比,雄性小鼠AST、ALP、A/G、GLU高于雌性小鼠,CHO、TG、TP、GLOB低于雌性小鼠(P< 0.05);同性别的Rag2 KO小鼠相比,5周小鼠TG、UN、CREA、ALP高于10周小鼠,TBIL低于10周小鼠(P< 0.05)。

2.3 Rag2 KO小鼠血液生理检测结果

由表3可见,同周龄的Rag2 KO小鼠相比,雄性小鼠PLT、PCT、WBC、LYM%高于雌性小鼠(P< 0.05);同性别的Rag2 KO小鼠相比,10周小鼠RDW低于5周小鼠,WBC高于5周小鼠(P< 0.05)。

2.4 Rag2 KO小鼠免疫细胞测定结果

图1显示的是一只Rag2 KO小鼠外周血中T细胞及其亚群、B细胞、NK细胞和粒细胞的百分比。由图2 可见,Rag2 KO小鼠外周血无T细胞(0.36±0.15)%、CD4+T细胞(0.21±0.06)%、CD8+T细胞(0.23±0.07)%、CD19+ B细胞(0.28±0.04)%和B220+ B细胞(2.03±0.42)%)。NK细胞比例为(24.13±3.62)%,粒细胞比例为(57.20±3.85)%。

表1 Rag2 KO小鼠主要脏器重量(单位:g)

表2 Rag2 KO小鼠主要血生化指标检测结果

表3 Rag2 KO小鼠主要血生理指标检测结果

图1 Rag2 KO小鼠外周血免疫细胞百分比

图2 Rag2 KO小鼠免疫细胞百分比

3 结论

实验动物脏器重量是鉴定动物遗传品质的重要依据,同时也是动物实验中常用的重要基础数据。本实验避开小鼠6~8周龄性成熟激素调节较为不稳定阶段,为防止对生理生化及脏器产生影响,实验选取5周龄青年小鼠及10周龄壮年小鼠进行对比研究[5]。本研究结果表明同性别不同周龄小鼠,随着周龄增加各脏器重量递增。同一周龄的雌性小鼠和雄性小鼠相比较,肝脏、脾脏、心脏及双肾脏器重量雄性小鼠大于雌性小鼠。本研究结果与Jackson Laboratory 及SLC所公布的C57BL/6J小鼠各脏器参数比较,除了脾脏偏低,其他脏器无显著性差异[6-7]。脾脏偏低可能由于该小鼠为基因敲除小鼠引起,同时饲料、环境等因素也可引起该脏器重量偏低[8]。

本实验对Rag2 KO进行了15种血液生化指标的测定和初步统计。结果显示,同周龄的Rag2 KO小鼠雄鼠和雌鼠相比,CHO、TP、GLOB三个指标雄性小鼠高于雌性小鼠;AST、ALP、A/G、GLU四个指标雌性小鼠高于雄性小鼠。5周与10周同性别的Rag2 KO小鼠相比,TBIL 随着周龄增加而递增,TG、UN、CREA、ALP随着周龄增加而递减。这是否是在一定时间内(如3个月以上) 可能呈现规律性变化,还有待进一步研究。可见年龄及性别因素对部分血液生化指标的影响是十分明显的,但是也与品种品系不同、饲养环境不同等多种因素有关,切不可一概而论[9-10]。本研究结果与Jackson Laboratory、Charles river 及SLC所公布的C57BL/6J小鼠血液生化指标比较,Jackson Laboratory、Charles river两个公司公布的数据偏低,比SLC所公布的数据普遍偏高,可能由于动物品系不同有一定差异,Rag-2 KO小鼠为免疫缺陷小鼠,在外界更易产生应激使机体产生一系列生理生化变化,且缺少免疫细胞,易对外界刺激产生炎症反应。而C57为正常健康小鼠,不会对外界产生过于敏感的反应,生理生化值也相对稳定。同时由于饲料及环境等因素的影响也会导致生化指标的偏差[6-7,11]。

本实验对Rag2 KO进行了12种血液生理指标的测定和初步统计。结果显示,同周龄的Rag2 KO小鼠雄鼠和雌鼠相比,PLT、PCT、WBC、LYM% 雄性小鼠高于雌性小鼠;5周与10周同性别的Rag2 KO小鼠相比,RDW10随着周龄增加而递减,WBC随着周龄增加而递增。根据医学资料显示,RDW随周龄增大而减少,可能由于贫血造成;同时,WBC随周龄增加而增加,显示白细胞炎症增加。由于Rag2-KO为免疫缺陷小鼠,该两个指标的变化,初步推断由于该品系小鼠的生物学特性导致。本研究结果与Jackson Laboratory、Charles river 及SLC所公布的C57BL/6J小鼠部分血液生理指标比较,无显著差异[6-7,11]。

Rag2 KO小鼠表现型为严重的T/B细胞早期发育组滞。它的外周血没有成熟的循环T/B淋巴细胞,但是存在NK细胞(NK1.1+)和粒细胞(CD11b+),这与人重症联合免疫缺陷综合征SCID非常相似[12]。由于该基因小鼠特殊繁殖方式,为避免母体的抗体对Rag2 KO小鼠免疫检测造成干扰,特选离乳后2~3周动物,即6周龄小鼠进行检测。因此我们通过标记6周龄Rag2 KO小鼠全血中的CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、B220+、NK1.1+、CD11b+抗体检测Rag2 KO小鼠体内不同的免疫细胞情况,证实Rag2 KO小鼠表现为明显的T、B细胞联合免疫缺陷。Rag2 KO小鼠作为免疫缺陷动物,在异种移植及移植宿主的肿瘤研究和毒理学研究上得到了广泛的应用。

由于国内Rag2 KO小鼠研究刚起步,因此未见此动物脏器重量、血生理生化指标的报道。本研究为生物医学研究提供了基础数据。Rag2 KO小鼠作为实验动物在国内尚属先例,所以对它的一些基本生物学特性尚缺乏系统的研究。由于此动物现已形成一定规模,群体相对稳定,其生物学特性和健康状况也相对稳定,因此,记录和结果数据较为集中,本实验对该动物的主要血液生化指标的检测具有一定的参考意义,为其在生物医学领域中的应用提供了基础数据。

参考文献:

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[12] Callebaut I, Mornon J P. The V (D) J recombination activating protein RAG2 consists of a six-bladed propeller and a PHD fingerlike domain, as revealed by sequence analysis[J]. Cell. Molec. Life Sci.,1998, 54: 880-891.

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