HO-1高表达对脂肪干细胞在低氧无血清条件下的保护作用及机制*

周中新， 程 轶， 代传忠， 武维恒

(徐州医学院 1附属医院胸心外科， 2心血管研究所，江苏 徐州 221002；3徐州医学院第二附属医院心内科，江苏 徐州 221006)

脂肪干细胞(adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs)是具有自我更新能力，且在适宜微环境下具有多向分化潜能的原始细胞，在心肌梗死后可直接或间接对损伤的心肌组织进行细胞补充或组织修复。但是在心肌梗死灶缺血缺氧环境下，脂肪干细胞的存活率较低,影响其对心肌组织的修复作用。血红素氧合酶 1(heme oxygenase 1，HO-1)具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤性增殖效应，能产生对伤害性刺激的适应和保护性反应。本实验通过钴原卟啉(cobalt protoporphyrin，Copp)诱导ADSCs表达内源性HO-1，探讨内源性HO-1在低氧无血清条件下对ADSCs的保护作用及可能的分子机制。

材 料 和 方 法

1 动物

SPF级雄性SD大鼠，3周龄，体质量180～200 g，徐州医学院动物实验中心提供。

2 主要试剂

HO-1抑制剂锌原卟啉(Zinc protoporphyrin，Znpp，Strem)；HO-1诱导剂Copp(Frontier)；Ⅰ型胶原酶(Gibco)；NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白 (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC) 兔多克隆抗体(Santa Cruz)； cleaved caspase-1兔多克隆抗体(Cell signaling)；anti-HO-1兔多克隆抗体(Abcam)；β-actin蛋白兔多克隆Ⅰ抗(碧云天)；IRDye 680标记的山羊抗兔Ⅱ抗、IRDye 800CW标记的山羊抗小鼠Ⅱ抗(Invitrogen)；细胞内活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 荧光探针 (DCFH-DA) 购于Sigma 公司；IL-1β ELISA 检测试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司；其余所有试剂均为化学分析纯。

3 方法

3.1ADSCs的分离、培养 、鉴定 参照本课题组已发表文章[1]。

3.2Copp诱导HO-1表达的浓度曲线 将ADSCs调整密度为1×105cells/L，接种在培养瓶中，待细胞长至培养皿底面80%时，随机分为5组，分别加入含浓度为0、5、10、15、20 μmol/L Copp的完全培养基，常规培养24 h，提取总蛋白。Western blotting法检测各组HO-1蛋白水平。

3.3低氧无血清条件下ADSCs的实验分组 正常对照(control) 组：ADSCs在含完全培养基中常氧(37 ℃、21% O2、5%CO2)条件下培养；低氧无血清(serum-free and oxygen deprivation,SOD)组：用无血清的L-DMEM培养基在低氧(37 ℃，1% O2、5%CO2)条件下培养6 h；Copp组：将ADSCs在含浓度为20 μmol/L Copp的完全培养基常氧培养24 h后，再进行低氧无血清处理6 h；Znpp组: 将ADSCs在含浓度为20 μmol/L Copp和20 μmol/L Znpp的完全培养基常氧培养24 h后，再进行低氧无血清处理6 h。

3.4DAPI染色检测细胞凋亡率 ADSCs吸去培养基；4%多聚甲醛固定，双蒸水冲洗；加入DAPI染色液(工作液)常温避光孵育10 min；吸去DAPI染色液，双蒸水冲洗；荧光显微镜下观察拍照，每组样本随机选取6个视野计数细胞总数及核变性、缩小、凋亡小体等凋亡细胞数；凋亡率=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

3.5胞质蛋白的提取 收集细胞加1 mL冰冷的胞质提取液，超声破碎，悬浊液置于低温离心机中在4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清，再次4 ℃、12 000 r/min离心30 min，上清为胞浆成分。BCA法测蛋白浓度分装，置-80 ℃冰箱待用。

3.6Western blotting检测蛋白水平 取50 μL蛋白量样品，经10%SDS-PAGE电泳，以半干电转移法将凝胶内的蛋白质转至硝酸纤维膜上；将硝酸纤维膜放入封闭液中，室温1 h；用封闭液适量稀释的1抗4 ℃孵育过夜；Washing buffer洗膜，加入IRDye800CW或IRDye680标记的Ⅱ抗，室温避光孵育1 h；Washing buffer洗膜，用滤纸吸去水分；用Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描条带。

3.7ELISA 法测定细胞培养上清液中IL-1β含量 脂肪干细胞按分组处理6h后，收集细胞培养上清液, 1500 r/min离心，取上清，ELISA法测定IL-1β 浓度。在450 nm波长读取吸光度(absorbance,A)值,根据标准曲线计算样品浓度。

3.8细胞ROS水平测定 脂肪干细胞按分组处理6 h后，弃去上清液，PBS 清洗3遍，加入DCFH-DA (5 μmol/L)， 37 ℃避光孵育30 min，用PBS清洗2遍，TECAN 多功能酶标仪 (激发和吸收波长分别为488 nm 和525 nm) 读取荧光光强度，结果用荧光强度(AU)表示。

4 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，使用SPSS 16.0分析软件处理，统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CoPP可诱导ADSCs内源性HO-1的表达

正常条件下ADSCs不表达HO-1或者表达量很低，以至于Western blotting法无法检测到，而5 μmol/L浓度CoPP进行诱导后，ADSCs开始有少量HO-1表达。10 μmol/L浓度时，HO-1蛋白的表达明显增加(P<0.05)。CoPP对HO-1的诱导作用呈浓度依赖性，20 μmol/L组对HO-1诱导作用最强,见图1。

Figure 1. The expression of endogenous HO-1 in ADSCs induced by different concentrations of CoPP. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs 0 μmol/L group.

2 CoPP可诱导低氧无血清条件下ADSCs 中HO-1高表达

Western blotting 检测结果分析显示，低氧无血清可轻度诱导ADSCs中HO-1的表达，给予CoPP预处理后HO-1的表达显著升高(P<0.05)；CoPP诱导的HO-1高表达可被ZnPP逆转(P<0.05)，见图2。

Figure 2. Effects of Copp on HO-1 expression in ADSCs exposed to serum-free and oxygen deprivation. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs SOD group; △P<0.05 vs CoPP group.

3 HO-1的高表达可显著抑制低氧无血清条件下ADSCs的细胞凋亡率

DAPI染色结果显示，对照组可见正常细胞的胞核呈均匀的蓝色荧光，大小、形态较一致，ADSCs凋亡率为(4.09±1.26)%；SOD组可见部分细胞体积缩小，细胞质和细胞核浓缩，个别可见凋亡小体(箭头所指)，凋亡率为(28.91±2.57)%；CoPP组凋亡率为(15.17±1.40)%；ZnPP组凋亡率为(28.40±2.36)%。对照组与SOD、CoPP、ZnPP组凋亡率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；CoPP组与SOD、ZnPP组凋亡率比较差异均有统计学意义(P<0.05),见图3。

Figure 3. Effects of CoPP expression on the cell apoptotic rates of ADSCs exposed to serum and oxygen deprivation by DAPI staining. A: control group; B: SOD group; C：CoPP group； D： ZnPP group. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs SOD group and CoPP group.

4 HO-1的高表达可抑制低氧无血清条件下ADSCs 中NLRP3炎性小体的激活

Western blotting 法定量结果分析显示，与对照组比较，低氧无血清条件下NLRP3、ASC 和cleaved caspase-1(即活性caspase-1)蛋白水平明显升高(均P<0.05)；与SOD组比较，CoPP可明显抑制低氧无血清诱导的ADSCs 中NLRP3、ASC 和cleaved caspase-1蛋白水平(均P<0.05)，表明CoPP可抑制低氧无血清条件下脂肪干细胞NLRP3 炎症小体激活；CoPP产生的上述效应可被ZnPP逆转(均P<0.05)，见图4。

Figure 4. Effects of CoPP on NLRP3, ASC and cleaved caspase-1 expression levels in ADSCs exposed to serum-free and oxygen deprivation (SOD). Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs SOD and ZnPP groups.

5 HO-1高表达可减少低氧无血清条件下ADSCs 分泌 IL-1β

ELISA检测显示，正常培养条件下ADSCs 培养上清液中IL-1β量极低；与对照组比较，低氧无血清条件下ADSCs 培养上清液中IL-1β水平显著升高(P<0.05)；与SOD组比较，CoPP可明显减少ADSCs培养上清液中IL-1β水平(P<0.05)，表明CoPP对低氧无血清条件下ADSCs 分泌IL-1β具有明显的抑制作用；CoPP产生的上述效应可被ZnPP逆转(P<0.05)，见表1。

6 HO-1高表达可减少低氧无血清条件下ADSCs 中ROS 的生成

如表1所示，正常培养条件下ADSCs 中ROS水平极低；与对照组比较，SOD组细胞内ROS 水平明显升高(P<0.05)；与SOD组比较，CoPP能明显抑制低氧无血清处理诱导的ADSCs内ROS 水平(P<0.05)；同时CoPP的上述效应可被ZnPP逆转(P<0.05)。

讨 论

近年来的动物实验和临床研究均证实，干细胞心脏移植能不同程度地改善心梗后心脏功能[2]，但改善程度有限，其可能原因是移植的干细胞在恶劣的梗死心肌环境下较低的生存率[3]。冠状动脉堵塞，心肌梗死区域缺血缺氧、自由基的大量产生，炎性细胞浸润、细胞毒性因子积聚，钙反常等因素造成移植的干细胞在恶劣的梗死心肌微环境下的生存率较低。所有这些因素不仅可以引起移植细胞的不可逆性缺血损伤，还可以启动凋亡程序，诱发移植细胞凋亡。因此，进一步促进移植的干细胞存活，减少移植后的凋亡，是提高心功能改善程度的关键步骤。

表1 CoPP对低氧无血清条件下ADSCs分泌IL-1β及细胞内ROS 水平的影响

HO-1又称血红素加氧酶-1，是血红素代谢的限速酶，可分解血红素生成一氧化碳、胆红素和游离铁。HO-1分布在全身多处组织和器官中，生理情况下，哺乳动物体内呈低水平表达，但可以被多种刺激物包括氧化损伤所诱导[4]。既往研究表明，HO-1具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗廇性增生效应，在缺血性心脏病发生发展的病理生理过程中发挥积极作用[5-6]。有研究利用HO-1基因转染BMSCs后再移植，可以提高BMSCs在缺血性心肌病组织中的存活率[7]。另研究显示利用腺病毒介导ADSCs过表达HO-1可以改善兔梗死心肌的心肌重构和心脏功能[8]。我们前期研究发现，利用慢病毒介导ADSCs过表达HO-1可以通过抑制经典凋亡通路中凋亡效应因子caspase-3 的活性对低氧无血清条件下的ADSCs起到保护作用[1]。本研究中我们通过CoPP诱导ADSCs内源性HO-1高表达，结果显示CoPP可明显减少ADSCs在低氧无血清条件下的凋亡率，表明诱导内源性HO-1的表达对低氧无血清环境下的ADSCs具有保护作用，与外源性提高HO-1的表达结果一致。本研究进一步重点探讨了内源性HO-1高表达是否可以通过除抑制经典凋亡通路以外的其他分子机制提高ADSCs在低氧无血清环境中的存活率。

固有免疫系统是构成机体抵御病原生物入侵的第一道防线。近年来越来越多的研究表明固有免疫的过度激活与多种疾病例如感染性疾病、缺血性疾病、2型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风，关节炎等的发生密切相关。NLRP3作为模式识别受体家族中最重要的一个成员，包括由N端的热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)、半胱天冬酶募集结构域(caspase recruitment domain，CARD)、核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding and oligomerization domain，NOD/NACHT)和C端的富含亮氨酸重复(leucine-rich repeat，LRR) 结构域构成。NLRP3能够识别细胞内的病原体以及细胞自身产生的危险信号，当配体被C末端的LRR识别后，NLRP3通过NOD结构域的寡聚作用发生构象重排，引发效应结构域的暴露，诱导具有相同CARD或PYD结构域的效应分子ASC聚集至N端，ASC作为双重接头蛋白分子以桥梁形式将NLRP3与caspase-l连接起来，形成NLRP3炎性小体，剪接并激活caspase-l[9]。活化的caspase-1重要功能之一是将无活性的IL-1β前体裂解为具有活性的成熟的IL-1β分泌到胞外，产生无菌性炎性反应[10]。活化的caspase-1的另一重要功能是介导细胞焦亡(pyroptosis)[11]。焦亡细胞在形态上有部分凋亡特征，例如细胞核浓缩，染色质DNA断裂以及DAPI、TUNEL染色阳性，但细胞膜完整性会丧失，胞内容物释放。因此，NLRP3 炎性小体在产生和扩大无菌性炎性反应的同时还直接通过激活caspase-1介导了自身细胞的死亡。本研究结果显示低氧无血清下ADSCs细胞中NLRP3炎性小体各成员NLRP3、ASC 和活性caspase-1蛋白表达明显升高，上清液中IL-1β水平显著升高，表明NLRP3 炎症小体激活是促进ADSCs在缺血微环境下死亡的机制之一。而CoPP可明显抑制低氧无血清诱导的ADSCs中NLRP3、ASC 和活性caspase-1蛋白水平，并减少ADSCs上清液中IL-1β水平，表明提高HO-1的表达可通过抑制ADSCs中NLRP3 炎症小体激活和IL-1β的分泌，对细胞产生保护作用。

近年来研究发现，线粒体来源的ROS是调节NLRP3 炎性小体活化的关键信号，线粒体功能失调，以产生大量的ROS进而激活NLRP3，并且ROS 的抑制剂或清除剂能抑制NLRP3 炎症小体的激活[12]。我们研究发现低氧无血清条件能明显升高ADSCs细胞内ROS 水平。因此，我们推测细胞内ROS 水平的升高也参与了低氧无血清条件下ADSCs细胞NLRP3炎症小体的激活。既往研究表明，HO-1具有抗炎、抗氧化的效应。我们的实验也证实CoPP可明显抑制低氧无血清诱导的ADSCs细胞内ROS水平，提示HO-1的高表达可能通过下调细胞内ROS 水平抑制ADSCs细胞NLRP3 炎症小体的激活。

[参 考 文 献]

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