血清水通道蛋白4抗体测定对视神经脊髓炎的诊断及预后判断价值*

厉 向， 童巧文， 柯建明， 叶莉萍， 戚飞腾， 万 真， 夏君慧△

(温州医科大学 1附属第一医院神经内科，2第三临床学院神经内科，浙江 温州 325000；3烟台市毓璜顶医院重症监护室,山东 烟台 264000)

视神经脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是一种特发性炎性脱髓鞘疾病，病变主要侵犯视神经和脊髓，导致严重的视神经炎和横贯性脊髓炎[1]。与多发性硬化(mutiple screlosis，MS)在临床上较难鉴别。常规治疗MS的β干扰素反而加重NMO及其疾病谱系患者的病情[2]，故尽早进行鉴别诊断尤为重要。Lennon等[3]在NMO患者血清中检测出特异性自身抗体NMO-IgG，并且证实其靶抗原为水通道蛋白4 (aquaporin 4, AQP4)， 有力地支持了NMO是有别于MS的自身抗体免疫性水通道病，此后越来越多的证据表明AQP4抗体参与到NMO的病理过程[4-5]。本研究以稳定表达人增强型绿色荧光蛋白-AQP4 (EGFP-AQP4)的人胚肾上皮细胞(human embryonic kidney epithelial 293, HEK293)为底物，建立检测血清AQP4抗体的CBA法，旨在讨论血清AQP4抗体检测对NMO患者的诊断、鉴别诊断及预后判断的价值，并探讨开展临床应用的可行性。

材 料 和 方 法

1 对象

回顾调查2010年1月至2013年12月在温州医科大学附属第一医院神经内科住院或门诊就诊并随访的206例患者，包括48例NMO、33例脊髓炎(transverse myelitis, TM)[包括26例长节段脊髓炎(脊髓MRI提示病灶大于3个脊髓节段)(longitudinally extensive transverse myelitis, LETM)和7例复发性脊髓炎(relapse longitudinally extensive transverse myelitis, rLETM)]、30例视神经炎(optic neuritis, ON)[其中包括25例双眼视神经炎(simultaneous bilateral optic neuritis, BON)和5例复发性视神经炎 (recurrent isolated optic neuritis, RION)]、52例MS及16例其它神经系统疾病(other neurological disease, OND)。OND包括7例脑梗死、2例帕金森病、3例头痛和6例脑出血患者。经医院伦理委员会审核，所有患者均由两位资深的神经内科医师确定诊断。入选标准：NMO组患者及其谱系疾病患者均采用Wingerchuk等[6]2006年修改版诊断标准(除血清AQP4抗体阳性外)。MS组患者均符合2010年McDonald诊断标准[7]。所有患者近期未进行免疫抑制剂或者激素治疗。

2 方法

2.1临床资料收集 通过对患者进行病史回顾及随访获得的临床资料分析包括性别、起病年龄、临床表现、病程、首发索引事件、诊断为NMO的时间、年复发率、严重视神经炎[功能评分 (function score，FS)>5分]和最近1次EDSS评分。辅助检查：包括脑脊液、视觉诱发电位(visual evoked potential，VEP)检查、抗核抗体(antiunuolear antibodies，ANA)自身抗体检测、头颅和脊髓MRI检查。清晨空腹采集所有患者静脉血，离心留取血清，保存于-80 ℃冰箱备用。

2.2细胞株构建及基因转染 参照Lennon等[3]文献中的AQP4转染HEK293细胞株方法。应用总RNA提取试剂盒提取成人脑组织总RNA行RT-PCR，以特异性引物扩增AQP4基因。上游引物：5’-CGCAGATCTGCCACCATGAGTGACAGACCCACAGC-3’，内含BglII酶切位点；下游引物：5’- CCGGTACCGGTACTGAAGACAATACCTC-3’，内含KpnⅠ酶切位点。将扩增产物克隆到pEGFP-N1(由温州医科大学附属第一医院医科所蒋磊博士惠赠)上，构建pEGFP-N1-AQP4重组质粒，双酶切和基因测序、基因比对鉴定。接种HEK293细胞(购自中科院上海细胞库)，24 h后细胞融合达90%，采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染。将pEGFP-N1+AQP4转染HEK293细胞。采用G418筛选稳定表达AQP4的细胞株。

2.3血清AQP4抗体检测 将稳定转染生长状态良好的重组质粒的HEK293细胞消化后铺板培养过夜，融合达50%左右。PBS漂洗后，予4%多聚甲醛室温下固定细胞30分钟。后加入5%驴血清室温封闭1 h。使用5%驴血清稀释待测血清，稀释比例分别为1∶20、1∶200、1∶600、1∶1 800和1∶3 600，与细胞共孵育，湿盒中4 ℃过夜。PBS漂洗后加入1∶400稀释的荧光标记驴抗人IgG(Abcam)，室温避光孵育2 h。PBS漂洗后加DAPI(Sigma)染细胞核。置于荧光显微镜(Leica)下观察细胞株，如图1。结合以往研究[8-9]，我们选定稀释浓度大于20倍时显示阳性的结果认为AQP4检测阳性，设定最小滴度为20倍。

Figure 1. Detection of specific AQP4 expression at the HEK293-AQP4/EGFP cells (×100). AQP4-expressing cells were incubated with detected serum and donkey antiserum specific for IgG. The colocalization of the surface-expressed AQP4(green) and the anti-IgG antibody(red) indicates that the antibodies are against AQP4. The merge shows that AQP4 was expressing on the surface of cell.

3 统计学处理

统计数据均采用SPSS 21.0软件包进行分析。非正态分布计量资料和计数资料用中位数(最小值，最大值)表示, 2个独立样本比较采用秩和检验。2个样本率的比较用Pearson2检验， 若T<5时，采用Fisher确切概率法。评价抗AQP4抗体对NMO的诊断价值，做受试者工作特征曲线(receive operating characteristic curve，ROC)进行比较。绘制Kaplan-Meier曲线分析血清AQP4抗体阳性患者进展为NMO的累计概率。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组AQP4抗体阳性率及滴度比较

患者的分组及各组AQP4抗体阳性率、抗体滴度见表1、图2。NMO组、TM组、ON组阳性率明显高于MS组(P<0.05)。其中rLETM组、RION组阳性率与NMO组比较，差异无统计学意义。LETM组阳性率亦高于MS组(P<0.05)。而BOD组阳性率与MS组无显著差异。OND组均为阴性。AQP4抗体滴度较高的患者基本集中于NMO组，其滴度分布与各组相比均具有显著差异(P<0.05)。

2 AQP4抗体诊断NMO的ROC曲线分析

以Wingerchuk等[6]2006年修改版诊断标准(除血清AQP4抗体阳性)为金标准，绘制评价血清AQP4抗体对NMO诊断的特异性和敏感性的ROC曲线分析，见图3。AQP4抗体曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.91，有统计学意义(P<0.05)。AQP4抗体滴度以大于20倍为阳性，其敏感性为87.5%，特异性为85.4%。

表1 各组别血清AQP4抗体滴度及阳性率比较

Figure 2. AQP4 antibody titers according to clinical phenotype.

Figure 3. ROC curve of serum AQP4 antibody for diagnosing NMO.

3 NMO组AQP4阳性患者及阴性患者临床特征比较

NMO组AQP4阳性组及阴性组的临床资料如表2所示。NMO组患者共48例，其中AQP4阳性患者为42例，阴性患者为6例。通过对临床特征进行比较，可见AQP4阳性患者中男性6例，女性36例，构成比约1∶6；阴性患者中男性3例，女性3例，构成比为1∶1，差异有统计学意义(P<0.05)。NMO组AQP4阳性患者发病年龄为16～63岁，中位数发病年龄为37.5岁，阴性患者发病年龄为14～32岁，中位数发病年龄为31.5岁，差异有统计学意义(P<0.05)。NMO组AQP4阳性患者确诊为NMO时间为0～96个月，中位数时间为12个月，阴性组确诊为NMO时间为1～102个月，中位数时间为28个月，差异有统计学意义(P<0.05)。NMO组AQP4阳性患者中严重视神经炎者(FS>5分)有13例，阴性组有2例，2组差异具有统计学意义(P<0.05)。而就年复发率、首发索引事件、脑脊液(cerebros-pinal fluid，CSF)表现、ANA抗体阳性率、EDSS评分及脊髓病变大于3个椎体节段的比例而言，NMO组AQP4阳性患者与阴性患者比较均无明显差异(P>0.05)。AQP4抗体阳性NMO患者有83.3%(35/42)在初次发病24个月后被确诊为NMO。而AQP4阴性NMO患者仅33.3%(2/6)在初次发病24个月后被确诊为NMO(P<0.05)。

表2 NMO组血清AQP4抗体阳性患者及阴性患者临床特征比较

4 AQP4抗体与发展为NMO的关系

应用Kaplan-Meier曲线分析188例血清AQP4抗体阳性和阴性的NMO、ON、TM和MS患者从首次发作进展为NMO的累积概率生存函数，见图4。该曲线显示AQP4抗体阳性组曲线明显低于抗体阴性组，提示AQP4抗体阳性患者进展为NMO的累积概率明显高于抗体阴性的患者(P<0.05)。

Figure 4. The Kaplan-Meier curve for the accumulated survival rate of AQP4 antibody for the progress to NMO

讨 论

NMO与MS临床症状有相似，尽管脑脊液寡克隆带、影像学有所不同，但因为缺乏较为特异性的生物学标志，鉴别诊断仍有困难。NMO-IgG及特异性靶抗原AQP4的发现，标志着NMO作为一种新的中枢神经系统自身免疫系统性疾病而独立于MS。AQP4抗体被认为通过以下途径参与病理过程：(1)参与血脑屏障的破坏；(2)启动炎症免疫反应，激活补体和细胞因子，导致血管周围的炎症细胞浸润；(3)介导星形胶质细胞损伤及脱髓鞘作用[10]。随着AQP4抗体的发现与检测，一些发病机制与NMO类似的非特异性炎性脱髓鞘疾病(如LETM、rLETM、RION等)的AQP4抗体阳性率也较高。2006年Wingerchuk等[6]将血清NMO-IgG纳入NMO的诊断标准，并提出了视神经脊髓炎谱系疾病(NMO spectrum disorders, NMOSD)这一概念。

随着AQP4抗体参与NMO的发病机制研究成为热点，关于NMO血清中AQP4抗体检测的实验大量开展。国内外学者通过比较各种检测血清AQP4抗体的方法[11-12]，发现CBA法的敏感性为最高(72.4%～91%)，且保持100%的特异性，明显优于间接免疫荧光法、ELISA法等。该方法最初由Lennon等[3]在2005年采用，具有以下优点：(1)CBA法采用人AQP4转染至胚肾细胞系HEK293中，避免种属的差异，明显优于传统应用冰冻鼠小脑或脑干切片上测定抗体的IIF法；(2)CBA法表达全肽段的自然折叠的人类AQP4抗原，从而避免了在氨基酸序列上及结构的差异影响，与人AQP4抗体特异性结合，而传统的ELISA法应用人工合成的AQP4蛋白或者多肽，导致蛋白空间结构异常而无法特异性结合AQP4抗体[13]。本实验应用CBA法是通过稳定表达AQP4的HEK293作为底物，来检测血清AQP4抗体。本实验通过ROC曲线评价AQP4抗体水平的诊断效益显示AQP4抗体对诊断NMO的敏感性为87.5%，特异性为85.4%，AUC达到0.91。AQP4抗体阳性率与国内及其它亚洲国家研究结果相似(73%～91%)[14-15]，提示血清AQP4抗体水平对诊断NMO具有较高的诊断效益。各组阳性率比较显示NMO组、rLETM组、RION组阳性率明显高于其它组，均在80%左右。Chan等[11]同样应用CBA法测定血清AQP4抗体，发现rLETM(75%)和RION(33%)的阳性率均高于单次发病的TM(4%)和ON(14%)。结合80%～90%NMO患者由rLETM和RION发展而来[1， 6]，来看这两类NMOSDs血清AQP4抗体阳性发病形式的患者有较大可能转化为NMO。而MS组存在2例患者血清AQP4抗体阳性，1例患者为进展型MS，另1例曾有视神经受累。故需进一步随访是否转归为NMO。

本实验在调查随访的浙南地区视神经脊髓炎患者中，比较了AQP抗体阳性与阴性患者的临床特征。NMO组阳性患者(1∶6)较阴性患者(1∶1)更倾向于女性，结果符合之前NMO研究的性别特征[16]。NMO组AQP4抗体阴性患者中位数发病年龄(31岁)较AQP4抗体阳性(37.5岁)患者年轻，这与既往国内外结果一致[15, 17]。类似研究[13, 16]发现AQP4抗体阳性患者更倾向于出现严重视神经炎(FS>5，即坏眼矫正视力小于0.1)。本实验NMO组AQP4抗体阳性患者(13/36)存在严重视神经炎的比例高于AQP4抗体阴性患者(P<0.05)，提示血清AQP4抗体与病情程度可能相关。同时我们发现NMO组AQP4抗体阳性患者确诊为NMO的中位数时间(12个月)较阴性患者(28个月)明显缩短，且2年内诊断为NMO的血清AQP4阳性患者明显多于血清AQP4阴性患者。而Jarius等[17]针对高加索人种的多中心临床研究发现AQP4抗体阴性患者确诊为NMO所需时间较阳性组短，考虑本实验与该实验结果不同的原因可能是人种及地域、起病形式的不同及样本量大小有关，需今后加大样本量后回顾研究。而年复发率、首发索引事件、脑脊液结果、ANA抗体、EDSS评分和病变累及大于3个脊髓节段等指标，NMO组AQP4阳性患者与阴性患者比较，均无明显差异。

我们回顾调查并随访188例NMO、ON、TM和MS等非特异性炎性脱髓鞘疾病患者，记录其首次发作时间及临床表现，并检测其血清AQP4抗体，应用Kaplan-Meier曲线分析AQP4抗体阳性和阴性的患者从首次发作进展为NMO的累积概率生存函数。曲线提示AQP4抗体阳性患者进展为NMO的累积概率明显高于抗体阴性的患者，并且AQP4阳性患者进展为NMO的速度更快。故若首发出现ON或者LETM的患者同时合并血清AQP4抗体阳性，提示具有短期内进展为NMO的高危风险，应进行长期随访证实，及时进行免疫调节或免疫抑制治疗。

综上所述，本实验所采用细胞免疫荧光法检测AQP4抗体可行有效，对于诊断NMO有较高敏感性和特异性。AQP4抗体阳性NMO患者更易出现严重视力损害，AQP4抗体阳性患者更快进展为NMO。可以提倡AQP4抗体检测作为鉴别NMO和其它脱髓鞘疾病的临床生物指标，有助于对NMO的早期诊断和转归预后预测。

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