补肾柔肝方对肝纤维化大鼠肝组织病理学以及α-SMA蛋白表达的影响

郑亚江，周振华，任 朦，祝峻峰

(1. 上海市中医医院，上海 200071；2. 上海市曙光医院，上海 201203)

补肾柔肝方对肝纤维化大鼠肝组织病理学以及α-SMA蛋白表达的影响

郑亚江1，周振华2，任 朦1，祝峻峰1

(1. 上海市中医医院，上海 200071；2. 上海市曙光医院，上海 201203)

目的 观察补肾柔肝方对肝纤维化大鼠肝组织病理学的影响。方法 SD大鼠随机分为空白对照组8只、模型组15只、秋水仙碱组15只、补肾柔肝方组15只。均以标准鼠食饲养,自由饮水,除空白对照组外，其余各组大鼠采用CCl4造模8周制备肝纤维化模型。从第9周开始，秋水仙碱组、补肾柔肝方组灌胃相应药物，空白对照组、模型组灌胃等体积生理盐水，均连续灌胃8周。末次给药后2 h，取肝组织进行HE、天狼猩红染色，评价肝细胞变性与胶原纤维增生程度。分别采用RT-PCR法和蛋白印迹法检测肝组织α-SMA表达情况。结果 补肾柔肝方组大鼠肝脏的纤维化程度明显低于模型组；与空白对照组相比，模型组大鼠的α-SMA蛋白表达明显升高(P<0.01)；与模型组相比，秋水仙碱组及补肾柔肝方组α-SMA蛋白表达水平有所降低(P均<0.05)。结论 补肾柔肝方能够降低大鼠肝脏内α-SMA蛋白的表达水平，具有明确的抗肝纤维化作用。

补肾柔肝方；肝纤维化大鼠；α-SMA蛋白

肝纤维化(LF)是肝细胞发生坏死或炎症刺激时，因细胞外基质(ECM)合成、降解与沉积不平衡而引起的病理过程，是涉及复杂的细胞及分子机制的动态过程。LF是各种慢性肝病重要的病理特征，也是进一步向肝硬化发展的主要中间环节，若病因持续存在，肝小叶及血管等逐渐被改建，肝脏的正常结构遭到破坏，中心静脉区和汇管区出现间隔、假小叶形成，即发展为不可逆转的肝硬化[1-2]。补肾柔肝方是根据中医关于肝纤维化“脾肾亏虚、瘀血阻络”的病机，由仙灵脾、炙鳖甲、丹参等药物组成的经验方，是治疗慢性肝病肝纤维化较为安全、有效的中药复方。本实验通过观察肝纤维化大鼠肝组织学的改变，旨在明确补肾柔肝方对肝纤维化大鼠肝组织病理学的影响。

1 实验资料

1.1 实验材料 补肾柔肝方，由上海中医药大学曙光医院制剂室提供，水浴蒸发至每毫升含生药3.5 g的流浸膏；秋水仙碱，云南植物药业有限公司生产，产品编号01420249708；α-SMA，Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA批号：sc-53142；RT-PCR试剂盒，Thermo公司K0241；轮转切片机(RM2035)；HI1220烤片机，德国Leica公司；LEICA EG1160 石蜡包埋机。

1.2 动物及分组 雄性Wistar 大鼠53只，清洁级，体质量180～200 g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2008-0015。动物随机分为空白对照组8只、模型组15只、秋水仙碱组15只、补肾柔肝方组15只。

1.3 模型制备及动物处理 实验开始时，除空白对照组外，其余各组大鼠首次于背部皮下注射纯CCl45 mL/kg，3 d后皮下注射40% CCl4花生油3 mL/kg，每周2次，而空白对照组首次注射等体积的生理盐水，以后皮下注射花生油3 mL/kg，造模8周。从第9周开始秋水仙碱组给予秋水仙碱水溶液5 mL/(kg·d)灌胃，补肾柔肝方组给予补肾柔肝方流浸膏5 mL/(kg·d)灌胃，空白对照组、模型组则给予同等体积生理盐水灌胃，均连续8周。实验期间所有大鼠标准饮食。末次给药后，禁食24 h，在乙醚麻醉、无菌无热源条件下，从大鼠腹主动脉采血，注入无热源玻璃试管中，3 000 r/min 4 ℃离心20 min，吸出血浆置于玻璃试管中封口，于-80 ℃低温保存。摘除肝脏、脾脏、肾脏，用4 ℃生理盐水冲洗，滤纸吸干多余水分，称质量，计算肝、脾、肾脏指数。脏器指数=脏器质量(g)/个体质量(g)×100%。每只大鼠取相同部位肝脏用甲醛固定，其余部分肝脏-80 ℃低温冰箱保存，以备病理检查和免疫组化检测。

1.4 检测指标

1.4.1 肝组织病理染色 将肝组织立即固定于4%多聚甲醛缓冲液，24内石蜡包埋，4 μm切片，分别行HE、天狼猩染色。镜检观察肝细胞变性、胶原纤维增生程度。

1.4.2 RT-PCR法检测肝组织中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达 TRIzol法提取肝组织总RNA，进行RT-PCR扩增，引物设计采用bioinformatics软件。PCR反应参数：94 ℃预变性7 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延伸3 min。取上述反应产物6 μL于1.0%含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，以DNA Maker(DL2000)作为标准分子量标记，电泳后用紫外透射仪观察，并用数码照相机照相，输入微机应用法国VL公司BIO-PROFIF凝胶图像分析系统对目的电泳条带进行分析，以相应的内参(GAPDH)电勇条带作为参照，结果以两者之积分吸光度的比值表示。

1.4.3 蛋白印迹法检测肝组织中α-SMA的表达 取100 mg肝组织置于1 mL组织匀浆缓冲液(20 mmol/L氯化钠,1%NonidetP40，0.1%十二烷基硫酸钠，50 mmol/L三氨基甲烷，5 mmol/L乙二胺四乙酸，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，1%蛋白酶抑制剂)中匀浆，测定总蛋白含量。取30 μg总蛋白含量的裂解液进行10%SDS-PAGE变性凝胶电泳。经硝酸纤维素膜转移。脱脂奶粉封闭，分别与特异性α-SMA(浓度均为1∶200)孵育，洗涤，再以辣根过氧化物酶耦联的第二抗体作用，反应信号经化学荧光底物发光，X射线片曝光。并以计算机图像扫描图像分析，测定灰度值。以同一张蛋白印迹膜曝光后以0.5%十二烷基硫酸钠洗脱，再以GAPDH孵育杂交，作为内参照。每个实验重复3批以上不同样本。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况比较 空白对照组大鼠生长状态良好，体质量增加显著，皮毛光滑，二便如常；模型组大鼠活动少，精神萎靡，胡须下垂，喜睡少动，体质量增加减少，甚至较前下降，皮毛不光滑，尿色黄，量偏少，大便次数增多，2～3次，不成形；秋水仙碱组大鼠生活状态好于模型组，体质量增加减少，皮毛欠光滑；补肾柔肝方组大鼠一般状态明显好于模型组。在8周的治疗过程中，空白对照组大鼠无死亡，而模型组大鼠死亡4只，补肾柔肝方组死亡1只，秋水仙碱组死亡1只。

2.2 各组肝纤维化大鼠器官指数比较 与空白对照组相比，模型组大鼠肝脾指数均明显上升(P均<0.01)，肾指数无明显变化；与模型组相比，秋水仙碱组肝指数下降(P<0.05)，脾指数无变化；而补肾柔肝方组肝脾指数均明显下降(P均<0.05)。见表1。

表1 各组肝纤维化大鼠器官指数比较±s，%)

注：①与空白对照组比较，P<0.01；②与模型组比较，P<0.05；③与模型组比较,P<0.01。

2.3 各组肝组织病理学表现

2.3.1 HE染色 光镜下观察可见，空白对照组大鼠肝组织未见明显变化，肝细胞条索排列整齐，未见明显变性、坏死，肝实质内未见明显炎症细胞浸润，见图1。模型组大鼠肝组织内大部分小叶结构受到破坏，纤维结缔组织增生，假小叶形成，肝组织大片坏死呈空网状，其间可见脂肪变性，增生的纤维组织中可见大量炎性细胞浸润，见图2。补肾柔肝方组和秋水仙碱组大鼠肝组织可见局灶性坏死，汇管区纤维组织增生，形成小的条索，有少许炎性细胞浸润，有散在的假小叶形成，脂肪变性比较轻，见图3和图4。

2.3.2 天狼猩红染色 空白对照组肝组织正常，见图5。模型组大鼠肝脏正常肝小叶结构消失，伴有明显的纤维结缔组织增生，形成典型的假小叶结构，见图6。而秋水仙碱组及补肾柔肝方组大鼠肝脏的纤维化程度明显低于模型组，见图7及图8。

图1 空白对照组肝组织HE染色表现

图2 模型组肝组织HE染色表现

图3 秋水仙碱组肝组织HE染色表现

图4 补肾柔肝方组肝组织HE染色表现

图5 空白对照组天狼猩红染色表现

图6 模型组天狼猩红染色表现

图7 秋水仙碱组天狼猩红染色表现

图8 补肾柔肝方组天狼猩红染色表现

2.4 各组肝脏 α-SMA mRNA表达情况 空白对照组、模型组、秋水仙碱组、补肾柔肝方组肝脏α-SMA表达值分别为0.5±0.18，3.2±0.17，1.81±0.11，1.83±0.13。与空白对照组相比，模型组大鼠的α-SMA蛋白表达明显升高(P<0.01)；与模型组相比，秋水仙碱组及补肾柔肝方组α-SMA蛋白表达水平有所降低(P均<0.05)。

2.5 蛋白印迹法示各组肝脏α-SMA蛋白表达情况 见图9。

0为空白对照组；1为模型组；2为补肾柔肝方组；3为秋水仙碱组

3 讨 论

肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化发生的中心环节。激活后的HSC除了细胞的表型发生改变―转化为肌成纤维细胞(MFB)外，还表达大量的特异性标志蛋白α-SMA，因此α-SMA 被认为是肌成纤维细胞的特异性标志物。检测α-SMA 在肝组织中的表达可以反映HSC的活化情况，也是评估肝纤维化程度的重要指标之一[1-2]。

作为各种慢性肝损伤共有的病理组织变化，肝纤维化是慢性肝病进一步发展为肝硬化的必经阶段。从肝纤维化到肝硬化是一个缓慢渐进的过程，若能早期发现并予有效治疗，肝纤维化是可以被逆转的。但迄今尚无安全、高效、理想的抗肝纤维化药物。因此寻求疗效可靠的药物和治疗方案是亟待解决的问题。

中医认为肝纤维化是一个动态变化的病理过程，其病因病机多沿“湿-热-毒-瘀-虚”发展。本实验中所用的补肾柔肝方系王灵台教授从医数十年摸索总结而成，方中仙灵脾功专补肾益精，“专壮肾阳”(《本草正义》)，“真阳不足者宜之”(《本草纲目》)。炙鳖甲滋阴潜阳、软坚散结,“主心腹瘕症坚积”(《神农本草经》)，可“去血气、破结、恶血”(《日华子本草》)，二药共用为君。丹参祛瘀生新而不伤正，“主心腹邪气……破症除瘕”《(神农本草经)》，“能破宿血，补新血”《(本草纲目)》，“专入血分，其功在活血行血，内之达脏腑而化瘀滞，故积聚消而瘕破”(《本草正义》)，为臣；苦参苦寒入肝，既可清肝利胆，又能燥湿利尿导湿外出，使湿热尽则黄疸清，为佐。诸药合用，阴阳互求，补肾而不腻脾，活血而不出血，清肝而不伐肝，共奏补肾填精、活血软坚、清肝利胆之功。全方组方配伍紧凑，药专而力宏，攻补兼施，攻而不破，补而不腻，攻补力量较为平均，是治疗慢性肝病肝纤维化脾肾亏虚兼血瘀的有效中药处方。

在以往的一系列临床和实验研究中均证实补肾柔肝方能明显改善HA、PⅢP、LN等指标，下调CTGF和Ⅰ型胶原的表达，可以使HSC的活化得到抑制[3-6]。肝组织病理学检查是确诊肝纤维化最可靠最直接的方法。经补肾柔肝方治疗后，大鼠肝组织可见局灶性坏死，汇管区纤维组织增生，形成小的条索，有少许炎性细胞浸润，有散在的假小叶形成，脂肪变性比较轻，纤维化程度明显低于模型组，说明补肾柔肝方可显著减轻肝组织纤维化的程度和范围，具有明确的抗纤维化的作用。本研究RT-PCR检测结果显示：与空白对照组相比，模型组大鼠的α-SMA水平明显升高(P<0.01)；与模型组相比，秋水仙碱组及补肾柔肝方组α-SMA水平有所降低(P<0.05)；蛋白印迹法结果显示：模型组大鼠肝组织中α-SMA表达量明显上调，秋水仙碱组及补肾柔肝方组α-SMA的表达呈下降趋势，提示补肾柔肝方可降低α-SMA表达,抑制HSC活化和增殖，减少肝内纤维组织增生可能是其发挥抗肝纤维化作用主要机制之一。

[1] Dong R,Luo Y,Zheng S. α-SMA overexpression associated with increased liver fibrosis in infants with biliary atresia[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr,2012,55(6):653-656

[2] Mak KM,Chu E,Lau KH,et al. Liver fibrosis in elderly cadavers:localization of collagen types Ⅰ,Ⅲ and Ⅳ,α-smooth muscle actin,and elastic fibers[J]. Anat Rec (Hoboken),2012,295(7):1159-1167

[3] 张斌,万莫彬,王灵台. 补肾柔肝方治疗大鼠肝纤维的实验研究[J]. 中西医结合学报,2005,3(2):132-135

[4] 扈晓宇,陈云凤,王灵台. 灵甲柔肝方治疗慢性乙型肝炎后肝硬化43例[J]. 中医研究,2005,18(6):28-30

[5] 张斌,王灵台. 补肾柔肝方对二甲基亚硝安诱导大鼠肝纤维化的预防作用以及其作用机制[J]. 中西医结合学报,2008,6(9):934-937

[6] 张斌,王灵台. 补肾柔肝方对二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化后CTGFmRNA表达的影响[J]. 世界华人消化杂志,2008,16(20):2224-2228

Effect of Bushen Rougan decoction on pathology of liver tissue and expression of α-SMA in rats with liver fibrosis

Zheng Yajiang1, Zhou Zhenhua2, Ren Meng1, Zhu Junfeng1

(1. Shanghai Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200071, China; 2. Shuguang Hospital of Shanghai, Shanghai 201203, China)

Objective It is to observe the effect of Bushen Rougan decoction on liver tissue pathology in rats with liver fibrosis. Methods 53 SD rats were randomly divided into blank control group with 8 rats, model group with 15 rats, colchicina group with 15 rats and Bushen Rougan decoction group with 15 rats. All the rats were fed with standard rat food and given free drinking water. Except for the blank control group, the rats in the other groups were given CCl4for 8 weeks to establish liver fibrosis models. The rats in colchicina group and Bushen Rougan group were given the respective drugs by intragastric administration on the ninth week, and the rats in blank group and model group were given the same volume of normal saline intragastric administration. In 2 h after the last intragastric administration, liver tissue of the rats were gotten to do liver tissue HE, sirius red staining to evaluate the degree of liver cell degeneration of collagen fiber hyperplasia, and the expression of α-SMA in liver tissue was detected by PCR method and Western blotting. Results The degree of fibrosis of the rats in Bushen Rougan decoction group was significantly lower than that of model group. Compared with the normal group, the expression of α-SMA protein increased significantly in model group(P<0.01); compared with the rats in the model group, α-SMA protein expression in colchicine group and Bushen Rougan decoction group decreased (P<0.05). Conclusion Bushen Rougan decoction can reduce the expression level of α-SMA protein in rats with liver fibrosis and has definite effect of anti liver fibrosis.

Bushen Rougan decoction; liver fibrosis in rats; α-SMA protein

郑亚江，女，医学博士，副主任医师，长期从事慢性肝病的临床和实验研究。

上海市卫生局科研课题(20114058)

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.34.003

R-332

A

1008-8849(2014)34-3770-04

2014-05-20