六神丸对人肺癌A549细胞血管内皮生长因子表达的影响

齐元富，郑祎，黄利敏

(1.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011;2.山东中医药大学，山东 济南 250355)

肺癌严重威胁人类生命和健康，是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。我国肺癌病死率在城市已居肿瘤死亡首位，对肺癌的防治研究成为当今医学领域中重要的科研课题。六神丸方的组成包括麝香、牛黄、冰片、珍珠、制蟾酥、明雄黄，有清热解毒，消肿止痛的功效。笔者在前期的临床研究中发现六神丸能明显改善中晚期肺癌患者的生存质量，稳定瘤灶，控制转移，减轻化疗的毒副作用［1］。本实验通过体外实验探讨六神丸治疗肺癌的作用机制。

1 材料

实验所需细胞株、药物、试剂及仪器参见本课题组前期研究结果［2－5］。用适量生理盐水将研磨碎的六神丸溶解至实验所需浓度(8.4mg/kg)，在4℃保存备用。

将35只SD大鼠(雄性，体质量200g左右)随机分为对照组和观察组，其中对照组10只，观察组25只。观察组每日灌胃2次，每次给予六神丸溶液4ml，对照组每日给予等量生理盐水灌胃，连续3天。末次灌胃(灌药前禁食12h)后1h用戊巴比妥钠将其麻醉，从后腹主动脉及心室采血，无菌分离血清，灭活除菌后分装入小瓶，保存于－20℃。

2 方法

2.1 细胞培养及悬液制备

常规培养A549细胞，待细胞长满瓶底约80% 时进行传代，实验时取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液配制成1×105个/ml的细胞悬液备用。

2.2 MTT法检测细胞增殖

实验分为对照组(10%正常鼠血清组)和观察组，观察组再分为六神丸含药血清组、顺铂(DDP)组(DDP:1μg/ml)及DDP+六神丸联合组，其中六神丸含药血清组和联合组再分为5%、10%、15%、20%、25%五个梯度浓度组，共12组，每组再设8个复孔。将细胞悬液接种于96孔平底培养板中，每孔加入200μl，调零孔组为右下方剩余孔。将各组细胞常规培养，待细胞生长旺盛贴壁后，去掉原培养液，加入各浓度含药血清继续培养24、48、72h。于培养结束前4h加入浓度为5mg/ml的噻唑蓝(MTT)20μl/孔，继续培养4h，弃液，再加入二甲基亚砜(DMDSO)200μl/孔，震荡5min，用酶标仪于波长490nm处检测OD值，重复实验3次取平均OD值。生长抑制率IR(%)=(1－实验组平均OD值/空白对照平均OD值)×100%。

2.3 免疫组化法检测VEGF表达

将A549细胞悬液接种于经过高温消毒的盖玻片，并放入6孔板内，待细胞爬满玻片后弃培养液，加入不同浓度的血清及实验药物，再继续培养24h。后续实验步骤按试剂盒操作，封片后，将各组免疫组化片置于光学显微镜下观察，阳性细胞即胞质、胞核和胞膜为棕黄色颗粒者，选择阳性细胞较集中的区域，采集5个光镜视野输入到高清晰度彩色病理图文分析系统中，进行计算机完全定量分析。

2.4 RT－PCR法检测VEGF mRNA表达

实验分为对照组、5%、10%、15%含药鼠血清组、DDP组及DDP+10%含药鼠血清组，收集各组细胞，按总RNA抽提试剂盒操作步骤提取各组细胞总RNA，经分光光度仪测定 RNA浓度和纯度，A260/A280均在1.8～2.0之间，可以继续实验。取3μg总RNA于42℃逆转录1h后，以内参照基因(β－actin)作为内对照，进行半定量聚合酶链反应(PCR)扩增。VEGF:上游 5－TCGGGCCTCCGAAA －CCATGA －3'，下游5'－CCTGGTGAGAGATCTGGTTC －3'，基因片断长度为:516bp、648bp、720bp、771bp。β － actin:上游 5'－CGCTGCGCT－GGTCGTCGACA －3'，下游 5'－GTCACGCACGATTTC2CGCT－3'，基因片断长度为500bp。引物均由上海生物工程有限公司合成。取RT产物5μl，进行 PCR 反应:95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃ ～60℃复性 1min，72℃延伸 1min，共 30 个循环。采用Alpha凝胶成像系统摄取图像，结果以目的条带与对应的β－actin密度比值表示。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 六神丸对A549细胞增殖的抑制作用

实验结果显示，六神丸含药血清能一定程度上抑制A549细胞增殖(5%药血清组与对照组相比P＞0.05，其余含药血清组、DDP及联合组与对照组相比P＜0.05)，抑制作用随血药浓度增高而增强;DDP与六神丸含药血清合用，对抑制细胞增殖有明显的协同作用(P ＜0.05)。

3.2 六神丸对A549细胞VEGF蛋白表达的影响

结果见表1，图1。各含药鼠血清组、DDP组及联合组的VEGF表达明显低于对照组，有显著性差异(P＜0.05或0.01);VEGF表达量与六神丸浓度负相关;同时结果显示联合组的抑制作用更显著，表明二者合用有协同作用。

表1 六神丸含药血清对A549细胞VEGF表达的影响(s)

表1 六神丸含药血清对A549细胞VEGF表达的影响(s)

注:与对照组相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与 DDP组相比，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

组别 视野(n)平均光密度 平均灰度5 0.3069 ±0.03434 164.7 ±15.36 5%含药鼠血清组 5 0.2510±0.03196＊△△ 150.5±13.82△△10%含药鼠血清组 5 0.2035±0.04562＊＊△△ 123.3 ±10.24＊＊△△15%含药鼠血清组 5 0.1637±0.02199＊＊ 109.5±16.34＊＊DDP 组 5 0.1546±0.02130＊＊ 101.4 ±8.944＊＊DDP+10%含药鼠血清组 5 0.1007±0.0259＊＊△△ 85.8±10.20对照组＊＊△△

图1 六神丸对A549细胞VEGF蛋白表达的影响

3.3 六神丸对A549细胞VEGF mRNA表达的影响

结果见表2，图2。实验结果显示，各含药鼠血清组、DDP组及联合组的VEGF mRNA表达明显低于对照组，有显著性差异(P＜0.01)，表明VEGF mRNA表达量与六神丸的浓度成反比;联合组对VEGF mRNA表达的抑制作用更显著，表明DDP对六神丸的抑制作用有协同效果。

表2 六神丸含药血清对A549细胞VEGF mRNA的相对表达量(s)

表2 六神丸含药血清对A549细胞VEGF mRNA的相对表达量(s)

注:与对照组相比，＊＊P ＜0.01;与 DDP组相比，△△P ＜0.01。

组别 n RATIO(%)77.53 ±14.70 5%含药鼠血清组 6 65.96 ±10.63＊＊△△10%含药鼠血清组 6 52.87 ±5.82＊＊△△15%含药鼠血清组 6 41.22 ±3.18＊＊DDP 组 6 40.04 ±4.37＊＊DDP+10%含药鼠血清组 6 26.10 ±4.13对照组6＊＊△△

图2 六神丸对A549细胞VEGF mRNA表达的影响

4 讨论

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种由肿瘤细胞分泌的具有促进血管生成作用的重要细胞因子，它功能强大且能产生多种生物学效应，属于血小板衍生生长因子超家族，现已发现的VEGF相关基因家族包括6个分泌型的糖蛋白，分别为 VEGF－A，VEGF－B，VEGF－C，VEGF－D，VEGF－E和胎盘生长因子(placentagrowth factor，PDGF)－land －2［6－9］。研究表明，VEGF 可促进内皮细胞渗透、激活、存活、增殖、浸润和迁移，与肿瘤血管生成密切相关［10－13］。血管的生成对于肿瘤的生长和转移起着重要作用，因此，抑制VEGF途径被确认为是一种重要的、有效的抗癌模式。

本实验结果证实，六神丸含药血清能一定程度抑制人肺癌A549细胞的体外生长，与药物浓度呈正相关，且与顺铂有协同作用。本研究通过免疫组化法及RT－PCR法检测六神丸作用于人肺癌A549细胞对VEFG表达的影响，结果证实六神丸可显著下调人肺癌A549细胞VEGF的表达，这可能是六神丸抑制肺癌细胞生长的主要机制之一。

中医学认为，六淫外侵、饮食不节、五志过极等皆可于体内形成热毒，热毒灼伤阴津，炼液为痰，久而成瘀，阻滞于肺而发为肺癌。可见肺癌形成的重要病机之一即是“毒聚”。所以采用以毒攻毒治法，借助有毒之品的峻猛之力攻邪以消除毒聚。本实验选取作为攻毒法代表方药的六神丸从细胞及分子水平探索六神丸抗肺癌作用及其可能的分子机制，为其今后用于肺癌的治疗提供科学依据。

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［5］于连洋.纳米雄黄干预肺癌A549细胞对VEGF及HIF－1表达的影响［D］.济南:山东中医药大学，2012:2－3.

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