益气类中药对博莱霉素所致肺纤维化大鼠血管新生机制的影响

张伟，郑建，朱雪，王丽芹，杨景青，李莹莹，郭俊美

(1.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011;2.山东中医药大学，山东 济南 250014)

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是由各种原因引起的急慢性间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)的最终结局，以肺部炎症导致肺泡持续性损伤及细胞外基质的过度沉积为病理特点，其发病机制目前尚不明确，以往对于肺泡炎性变化、肺泡上皮损伤和成纤维细胞的增殖研究较多，而对于肺血管在肺纤维化发生发展中的变化及VEGF在肺纤维化中的作用研究较少。国外多项研究证实，肺纤维化与肺血管生成之间有着密切的关系［1－2］。本研究通过观察肺纤维化大鼠肺组织病理形态及VEGF的表达水平，探讨益气类中药对肺纤维化大鼠的作用及其机制。

1 文献数据分析

1.1 数据收集

以“咳嗽，肺痿，肺痹，间质性肺病，特发性间质性肺炎(特发性肺纤维化，特发性肺间质性肺炎)，非特异性间质性肺炎，尘肺，矽肺;中药，方剂”等为主题词，以知网、维普、万方、Elsevier ScienceDirect数据库为主要检索目标，检索自有文献记录以来所有报道的临床治疗和动物实验中用到的中药单药及复方，对其中符合纳入标准的文献进行筛选，按照“十一五规划教材”中国中医药出版社出版的《中药学》中的分类方法，将其归类，建立数据表格。

1.2 数据分析方法

采用频数分析方法，计算药物的种类及每味药的使用频次。对使用频次超过5次以上的药物，按药物的功效主治以分层聚类法进行聚类分析，SPSS 17.0软件完成。采用Apriori算法挖掘药对配伍规律，设最小支持度2%，可信度100%。结果见图1。

1.3 数据分析结果

通过以上分析方法显示，文献中治疗肺纤维化最常用的有活血化瘀类中药、化痰类中药、益气类中药、补阴类中药、清热解毒类中药等，该结果表明益气类中药在肺纤维化临床治疗中有着重要的作用，结果还显示益气类中药中常用的配伍组合为党参和黄芪，因此本研究选用党参、黄芪作为益气类中药代表药物。

图1 数据分析结果

2 仪器与动物

SPF级健康雄性SD大鼠32只，体质量(200±20)g(山东中医药大学实验动物中心，许可证号:SCXK(鲁)20110003)。益气类中药(党参、黄芪)、强的松(山东省中医院);博莱霉素 (invitrogen公司，批号1134142);10%水合氯醛(山东大学齐鲁医院);PCR(BIO －RAD，CFX96)。

3 方法

3.1 分组及造模 大鼠适应性饲养7天后，采用数字表法随机分为空白组、模型组、益气组、泼尼松组，每组8只，模型组、益气组、泼尼松组均采用博莱霉素(BLM)复制大鼠肺纤维化模型，气管内一次性按体质量(5mg/Kg)注入博莱霉素溶液A5(5mg/ml)，空白组以同样方法注入等体积生理盐水。

3.2 给药 造模后第2天起，益气组每日以党参(生药量1.8g/Kg)、黄芪(生药量 2.7g/Kg)水煎液灌胃，泼尼松组每日以泼尼松混悬液(3mg/Kg)灌胃，持续28天。

3.3 观察指标

3.3.1 病理学观察 第28天，各组大鼠以10%水合氯醛(50mg/Kg)腹腔注射麻醉，取左肺下叶用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片。病理切片行HE染色，采用Mikawa的［3］方法进行大鼠肺组织病理评分。根据以下四项指标进行观察:1)肺泡充血;2)出血;3)间隙或血管壁中性粒细胞浸润或聚集;4)肺泡间隔增厚或透明膜形成。评分标准:极轻度损伤0分;轻度损伤1分;中度损伤2分;重度损伤3分;严重损伤4分，以上四项得分相加作为总分。

3.3.2 聚合酶链式反应法检测肺组织中 VEGF的表达

取右肺下叶组织，洗净称取质量后，采用Trizol一步法提取肺组织总RNA，反转录制备cDNA，以cDNA为模板，在反应体系中加入目的基因和内参照基因的引物，设定参数，进行目的基因的扩增。目的基因序列:VEGF－F5’－CCTGGCTTTACTGCTGTACCT－3’，VEGF– R5’－GCTGGTAGACGTCCATGAACT－3’;内参(GAPDH)－F5’－ACGATACGGCTTGGACTCTGA－3’，GAPDH －R5’－AGACTTGGTAAGTTCGCCTTCG－3’。反应条件:95℃5min 进入循环，95℃10s，72℃30s，40 个循环。

3.4 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.01差异有显著统计学意义，P＜0.05差异有统计学意义。

4 结果

4.1 各组大鼠肺组织病理学观察

空白组大鼠肺组织结构正常，肺泡壁无充血、水肿，肺泡腔无出血，未见纤维化组织;模型组大鼠肺组织正常肺泡结构破坏，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔融合、闭陷、消失，大量炎性细胞浸润，间质毛细血管密集，纤维组织增生明显;益气组大鼠肺组织正常肺泡结构轻微破坏，肺泡间隔轻度增厚，少量炎性细胞浸润和纤维组织增生，间质毛细血管明显少于模型组;泼尼松组大鼠肺组织正常肺泡结构轻－中度破坏，肺泡间隔略增厚，少量炎性细胞浸润，可见纤维组织增生，间质毛细血管明显少于模型组。结果见图2和表1。

表1 各组大鼠肺组织病理评分(s)

表1 各组大鼠肺组织病理评分(s)

注:与空白组比较，△P ＜0.01;与模型组比较，▲P ＜0.01;与益气组比较，☆P ＜0.05。

组别 n 病理评分空白组0.00 ±0.00模型组 8 6.00 ±1.20△益气组 8 3.00 ±0.76△▲泼尼松组 8 4.38 ±1.60 8△▲☆

图2 各组大鼠组织病理学结果

模型组纤维化程度最重，与其他组相比较有显著性差异(P＜0.01);益气组、泼尼松组纤维化程度较模型组明显减轻(P＜0.01)，益气组较泼尼松组疗效更好，二者比较有统计学差异(P＜0.05)。

4.2 各组大鼠肺组织中VEGF－mRNA表达水平

与空白组比较，模型组VEGF－mRNA的表达水平明显增高，差异有显著的统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，益气组VEGF－mRNA的表达水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，泼尼松组较模型组VEGF－mRNA表达水平无显著性差异(P＞0.05)。结果见表2。

表2 各组大鼠肺组织中VEGF－mRNA的表达水平(s)

表2 各组大鼠肺组织中VEGF－mRNA的表达水平(s)

注:与空白组比较，△P ＜0.01;与模型组比较，▲P ＜0.01;与益气组比较，☆P ＜0.05。

VEGF－mRNA空白组组别n 30.20 ±20.26模型组 8 115.88 ±17.58△益气组 8 62.76 ±18.23△▲泼尼松组 8 94.58 ±31.11 8△☆

5 讨论

肺纤维化是一种以弥漫性肺泡炎、肺泡结构紊乱、肺间质纤维增生为特征的肺部疾病，预后较差，目前尚缺乏有效的治疗措施，其发病机制尚不明确。近年来许多研究表明，肺纤维化与肺血管生成之间有密切关系，调节过度血管生成可能会延缓肺纤维化的发生发展。

VEGF是一种特异的作用于血管内皮细胞的细胞因子，在肺内可由上皮细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞分泌，也可由肺间质细胞分泌。VEGF具有促进血管内皮细胞分裂、增殖、促进血管形成，并增加血管通透性和维持血管正常状态和完整性的作用［4］。在肺纤维化形成过程中，VEGF在肺组织中的高表达，可诱导肺血管内皮细胞的分裂、增殖，且VEGF作用于肺血管内皮细胞，能增加毛细血管的通透性，使血浆、炎细胞外渗，从而造成肺间质水肿及肺间质内大量的炎细胞浸润。而大量纤维蛋白原的外渗，形成了细胞外基质，为内皮细胞、成纤维细胞迁移，新生毛细血管网的建立提供了必要的基质，从而使成纤维细胞的聚集增加，胶原纤维合成和分泌增加并沉积在肺间质内，促进了肺纤维化的形成［5］。VEGF的表达水平能够反映血管新生的程度。

本研究结果显示，模型组VEGF－mRNA表达水平较空白组明显增高，表明VEGF在肺纤维化的发生发展中起重要作用，与文献一致;益气组和泼尼松组较模型组VEGF－mRNA表达水平明显降低，表明益气类中药和泼尼松对肺纤维化均有明显的治疗作用，而益气类中药在此机制上的调节效果优于泼尼松;病理形态学观察也同样证实了这个结论，益气组和泼尼松组大鼠的肺纤维化程度较模型组均明显减轻，间质毛细血管也较模型组明显减少。笔者推测这可能与益气类中药和泼尼松能够抑制VEGF－mRNA的表达有关，它们可能是通过抑制VEGF－mRNA的表达而改善肺纤维化大鼠毛细血管的通透性，减少炎性细胞及纤维蛋白原的渗出，从而起到抗炎和减少细胞外基质沉积的作用;还能抑制肺血管内皮细胞的过分增殖，维持血管正常状态，延缓肺纤维化大鼠肺毛细血管新生，防止肺动脉高压的行成，从而延缓肺纤维化进展。此外，中医认为肺纤维化属“肺痿”范畴，气虚血瘀贯穿疾病始终，益气类中药既可补气，改善气虚，又能补气［6］以行血，延缓血瘀的行成，从而达到治疗疾病的目的。

综上所述，益气类中药对肺纤维化大鼠有明显的治疗作用，其机制可能与降低VEGF的表达水平有关，本研究的这一发现为探索肺纤维化的发病机制和中医药防治肺纤维化的作用提供了实验依据。

［1］Stricter RM，Belperio JA，Keane MP.CXC chemokines in angiogenesis related to pulmonary fibrosis［J］.Chest，2002，122(6 Suppl):298 －301.

［2］Micheal PK，Seamas CD，John AB，et al.Imbalance in the expression of CXC chemokines correlates with bronchoalveolarlavage fluid angiogenic activity and procollagen levels in acute respiratory distress syndrome［J］.Immunol，2002，169(7):6515 －6521.

［3］Mikawa K，Nishina K，Takao Y，et al.ONO －1714，a nitric oxide synthase inhibitor，attenuates endotoxin—induced acute lung in rabbits［J］.Anestth Analg，2003，97(6):1751 －1755.

［4］Tuder RM，Yun JH.Vascular endothelial growth factor of the lung:friend or foe［J］.Curr Opin Pharmacol，2008，8(3):255 － 260.

［5］潘海英，常开齐，李梅香，等.博莱霉素诱发大鼠肺间质纤维化VEGF及其受体的表达及意义［J］.青海医药杂志，2004，34(3):1－4.

［6］张心月，贾新华，王立娟，等.从气血变化看肺间质纤维化［J］.中医药学报，2012，40(3):56－57.