超声波法提取丹酚酸B的工艺研究

王凤儒，李凤霞，金娟

(黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

丹参为唇形科植物丹参(Radix Salviae Miltiorrhizae Bag)的干燥根和根茎。别名赤参，又叫紫丹参，红根。是双子叶植物唇形科的干燥根及根茎。我国主要分布于山西省、安徽省、河南省、甘肃省、四川省等地。《神农本草经》等历代本草均有收载。丹参归心、肝经，药性微寒，味苦、无毒，具有祛瘀止痛、活血调经、养心除烦的功效［1］。丹参在临床上广泛用于治疗心血管系统疾病，具有扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、改善微循环、降低心肌耗氧量、防治心肌缺血和心肌梗塞等作用。临床研究表明，丹参化学提取物具有促进组织的修复与再生能力，包括清除坏死心肌细胞，促使肉芽形成，改善肝脏微循环，抗菌消炎等功效［2］。丹参的主要化学成分包括以丹参酚酸B为代表的水溶性酚酸类化合物和以丹参酮A为代表的醇溶性菲醌类化合物。其中脂溶性成分包括丹参酮、异丹参酮、丹参酸甲酯等。传统的丹参酮A的提取方法为水提醇沉，热碱提取法等，这也是目前制备丹参注射提取方法常用方法［3－6］。本文主要探讨超声波提取法对丹酚酸的最佳工艺，以扩大超声波提取丹参酚酸B的应用。

1 材料与仪器

RE522OA型旋转蒸发器(上海振捷实验设备有限公司);KQ2200E型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);高效液相色谱仪(Agilent 1200);丹酚酸B标准品(中国食品药品检定研究院，2013007);甲醇、乙腈、甲酸等试剂均为国产色谱纯。

2 方法

2.1 超声波法提取工艺

称取适量预处理的丹参粉末，单因素试验和正交试验超声波提取，浸提液4000r/min离心10min，上清液即为丹酚酸B的粗提液。在粗提液中加入无水乙醇至乙醇浓度80%，静置沉淀过夜。抽滤，沉淀经自然干燥后称重，以定提取物得率与丹酚酸B含量为指标，确定最佳提取工艺。

2.2 丹酚酸B含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Extend－C18(250mm ×4.6mm，5μm);流动相:甲醇:乙腈:甲酸:水(30:10:1:59);流速:1.5mL/min;波长:λ =286nm;进样体积:20μL;保留时间:20min;理论塔板数按丹参酚酸B峰计算不低于2000。

2.2.2 制备标准曲线

精密称定丹酚酸B对照品25mg，水解并定容至50mL。稀释丹酚酸 B浓度为 0.03125mg/mL、0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL标准液，分别按照2.2.1条件进样。以丹酚酸B浓度X为横坐标，峰面积 Y为纵坐标，Y=416.73X－16.312，R2=0.9999，得标准回归曲线。

2.2.3 待测溶液的制备

称取提取浸膏5g，置50mL量筒中，使充分溶解，滤过，精密量取续滤液1mL，至10mL容量瓶中定容。

2.2.4 样品中丹酚酸B测定

吸取待测溶液20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

3 结果与结论

3.1 单因素试验

3.1.1 料液比

保持提取温度40℃，提取时间30min，超声波频率40kHz，料液比分别为 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35提取，结果见图1。随着提取溶剂(水)的增加，丹酚酸B提取率逐渐升高，料液比为1∶25以后，随着料液比的增大得率增加趋势趋于缓和。因此，选择料液比1∶15，1∶20，1∶25 三个水平进行正交试验。

3.1.2 提取温度

保持料液比1∶20、提取时间30min、超声波频率40kHz，提取温度分别为 30、40、50、60、70℃提取，结果见图2。50℃ ～60℃之间多糖的提取率明显增加，60℃时达到最高值，超过60℃时，提取率下降。因此，选择提取温度40℃，50℃，60℃三个水平进行正交试验。

3.1.3 提取时间

保持料液比1∶20、提取温度50℃、超声波频率40kHz，分别在 20，25、30、35、40min 条件下提取，结果见图3。提取时间为30min时，得率最高，此后下降。推测随受热时间延长，部分丹酚酸B降解。综合考虑丹酚酸B的得率和节约能源，提取时间较为适宜的3个水平为25、30、35min，以此三个水平进行正交试验。

图2 提取温度对丹酚酸B得率的影响

图3 提取时间对丹酚酸B得率的影响

3.1.4 超声波频率

保持料液比 1∶20，提取温度 50℃，提取时间30min，超声波频率分别为 20，30，40，50，60kHz 时提取，结果见图4。超声波频率在40kHz之前丹酚酸B得率明显上升，此后略有下降。因此，选择超声波频率为30，40，50kHz三个水平进行正交试验。

图4 超声波频率对丹酚酸B得率的影响

3.2 正交试验

采用L9(34)正交设计，试验结果见表1。

影响丹酚酸B得率的主次为温度＞时间＞超声频率＞料液比。确定最佳提取工艺为提取温度40℃、提取时间25min、提取超声频率30kHz、料液比1∶25为理论最佳工艺。

按照理论最佳提取工艺，丹酚酸B提取得率为13.31%。

4 讨论

从丹参中提取丹酚酸B的过程主要有破碎、提取、沉淀、干燥等，是影响回收率和产品质量的主要环节。参考相关丹酚酸B提取的文献，主要提取方法有中性热水提取，水煎法，回流提取，超临界CO2，浸渍法。传统的丹参提取法提取丹参酸B得率低，对有效成分的破坏大，影响产品最终收率，并且产生大量杂质，影响到用药安全。超声波作为一种新的提取手段，提取效率高、经济方便、破碎效果好本试验确定提取丹酚酸B的最佳工艺组合为料液比1∶25、提取温度40℃、提取时间25min、超声波频率30kHz，丹酚酸B得率达13.31%，这种工艺提取出的浸膏量大并且含量较高。

［1］唐召力，覃碧云，滕秋叶，等.丹参多酚酸盐与丹参注射液对不稳定型心绞痛氧化修饰低密度脂蛋白、血友病因子和超敏C反应蛋白的作用比较［J］.临床荟萃，2012，27(17):1495 －1497.

［2］杜中良，程振田.正交试验法优选丹参中丹酚酸B的提取工艺［J］.中国药房，2010，31(3):35 －44.

［3］高秀梅，邢永发，姬艳苏.丹参酚酸B、丹参酮治疗心血管疾病的药理学研究进展［J］.上海中医药杂志，2012，44(7):82 －85.

［4］李学林，姚保杰，李春晓.丹参及其制剂对血小板功能影响的研究进展［J］.中国药房，2013，24(7):670 －672.

［5］杨立波，陈延军，郝东伟.注射用丹参多酚酸盐联合通心络胶囊治疗不稳定型心绞痛的临床观察［J］.中国医药科学，2012，6(11):59－62.

［6］王凤儒，李凤霞，金娟.丹参多酚酸盐对冠心病患者免疫相关指标的影响［J］.中医药学报，2014，42(3):181 －183.