宫颈癌新辅助化疗miRNA的差异表达

李连香，陈丽宏

(陕西省人民医院，陕西 西安 710068)

宫颈癌新辅助化疗miRNA的差异表达

李连香，陈丽宏

(陕西省人民医院，陕西 西安 710068)

目的 观察宫颈癌新辅助化疗相关的差异miRNA表达谱，明确与宫颈癌新辅助化疗相关的miRNA表达分子机制。方法 从宫颈癌患者新辅助化疗前后的肿瘤组织标本中筛选出3对标本(均为宫颈癌Ⅱb期高分化鳞状上皮细胞癌)，利用Agilent microRNA芯片检测法，初步筛选与新辅助化疗相关的miRNA表达谱。结果 初步筛选出56个差异表达的miRNA，其中29个miRNA在新辅助化疗后表达上调，占总数的52%；27个miRNA表达下调，占总数的48%。结合文献筛选出5个宫颈癌相关的miRNA。结论 宫颈癌新辅助化疗与5个miRNA的差异性表达具有相关性。

宫颈癌；新辅助化疗；miRNA

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，发病率在我国妇科恶性肿瘤中居首位。死亡率居女性癌症的第二位。局部晚期(Ⅱb～Ⅳa)宫颈癌及巨块型(肿块直径≥4 cm，Ⅰb～Ⅱa期)宫颈癌疗效差、复发及病死率高。子宫动脉介入化栓术(新辅助化疗)经子宫动脉或髂内动脉局部注射高浓度、大剂量化疗药物，通过抗癌药物在肿瘤组织内的浓度增加，来减缓病灶发展，尽量避免淋巴结转移及亚临床播散。在先期临床治疗实践的基础上，本实验从前述宫颈癌患者新辅助化疗前后的肿瘤组织标本中筛选出3对标本(均为宫颈癌Ⅱb期高分化鳞状上皮细胞癌)，利用Agilent micro RNA芯片检测法，初步筛选与新辅助化疗相关的miRNA表达谱，为进一步验证相关miRNA在宫颈癌新辅助化疗中的作用做准备。

1 临床资料

1.1 一般资料 于新辅助化疗治疗前后收集宫颈癌患者肿瘤组织标本。治疗前所有病例均经宫颈活检病理学证实为宫颈高分化鳞癌。临床分期Ⅱa期均为巨块型，肿瘤直径≥4 cm。排除在本次治疗前接受过放射治疗、化学治疗、免疫治疗、物理治疗者。

1.2 标本采集和保存 按照RNA实验要求，准备切取组织所需器械和无菌的冻存管，器具均经0.1%的DEPC水浸泡过夜。术中切除子宫后，肉眼判断肿瘤组织并切取0.5 cm3大小组织标本1块，装入冻存管后立即投入液氮保存，用于芯片检查。

1.3 芯片检测 收集宫颈癌患者新辅助化疗前后的组织标本，送至上海伯豪生物技术有限公司进行芯片检测。

2 结 果

2.1 miRNA芯片样品数量与患者信息 共取新辅助化疗前后3对样本，患者信息见表1。

2.2 miRNA芯片结果初步筛选 miRNA芯片结果初步筛选化疗前后差异表达的miRNA(图1及图2)，筛选原则为：FDR控制在5%内，Fold change 为1.5倍以上。初步筛选出56个差异表达的miRNA，其中29个miRNA在新辅助化疗后表达上调，占总数的52%；27个miRNA表达下调，占总数的48%。

表1 miRNA芯片样品数量与患者信息

统计结果见表2及表3。

图1 新辅助化疗前生物芯片杂交图

图2 新辅助化疗后生物芯片杂交图

2.3 结合文献筛选与宫颈癌相关的miRNA 以初步筛选的56个差异表达miRNA为基础，进一步筛选出与宫颈癌新辅助化疗相关5个miRNA，这5个miRNA均与宫颈癌治疗相关，且经miRNA芯片验证其表达水平在新辅助化疗前后差异超过1.5倍，这5个miRNA分别为has-miR-21、has-miR-23b、has-miR-99b、has-miR-143、has-miR-200b。has-miR-21在miRBase中的成熟序列号为 MIMAT0000076，基因序列为uagcuuaucagacugauguuga；has-miR-23b序列号为 MIMAT0004587，基因序列为uggguuccuggcaugcugauuu；has-miR-99b序列号为 MIMAT0000689，基因序列为caagcucgugucuguggguccg；has-miR-143序列号为MIMAT0004599，基因序列为ggugcagugcugcaucucuggu；has-miR-200b序列号为MIMAT0004571，基因序列为caucuuacugggcagcauugga。

3 讨 论

前期临床实践表明，新辅助化疗对宫颈癌的治疗效果显著，然而对宫颈癌新辅助化疗的分子机制尚不明确。microRNA(miRNA)是一类长19～25个核苷酸的小分子非编码 RNA，可通过与特定 mRNA结合或调节特定mRNA的蛋白质翻译过程来调控基因的表达，参与生长发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等生命过程[1-2]。现今，生物芯片检测筛查miRNA表达谱在肿瘤研究中得到了越来越广泛的应用。利用肿瘤发生发展过程中所出现的特异性miRNA的异常表达，不仅可以区分不同肿瘤的起源 ,同时也可以反映肿瘤发展的不同阶段[3]。miRNA表达具有细胞和组织特异性。与正常组织或细胞相比，肿瘤细胞miRNA表达的变化可以是特异性增高或降低,两者对于肿瘤的诊断都有意义。肿瘤经过干预后，miRNA的表达也可以是特异性增高或降低，提示该干预因素可能涉及的分子机制。随着miRNA芯片技术的发展和广泛使用，已确定miRNAs表达异常在多种恶性肿瘤中存在。研究发现在肿瘤中miRNA表达可上调或下调，提示miRNA可能为一类新的肿瘤标志物，从而推断miRNA也可能成为将来肿瘤治疗的新靶点[4]。本研究所收集的病例均为宫颈鳞癌，治疗前后miRNA有显著性差异的分别为has-miR-21，has-miR-23b，has-miR-99b，has-miR-143，has-miR-200b。通过提取宫颈癌组织miRNA，本研究发现miR-21的表达在新辅助化疗治疗前呈高表达，而在治疗后下降显著。Meng等[5]研究发现，抑制miR-21引起肿瘤细胞增殖、转移和浸入能力的减弱。相反，增强miR-21的表达则会促进肿瘤增殖，侵袭性增强。近来也有研究显示，miR-21在子宫颈上皮癌中的表达相对正常上皮细胞表达上调，而其对肿瘤的作用可能是通过调控下游的靶分子抑癌基因Pdcd4的表达来实现[6]。

表2 宫颈癌新辅助化疗前后上调表达的miRNA

表3 宫颈癌新辅助化疗前后下调表达的miRNA

miRNA-200b可能是与肿瘤的发生发展关系密切的癌基因。Schmittgen等[7]的研究发现miRNA-200b在子宫内膜癌中呈上调表达。高危胰腺导管癌的miRNA-200b表达是低转移性癌表达的60余倍，而癌症发生的可能原因是miRNA-200b通过上调作用，降低了靶基因EP300表达，而EP300是与肿瘤转移相关的重要抑癌基因。另外胆管癌细胞株中miRNA-200b上调表达显著，通过抑制miRNA-200b的表达可抑制肿瘤细胞增生,同时增加化疗药物敏感性,反之则促进肿瘤细胞生长，推测它的靶基因是一肿瘤抑制基因PTPN12[8]。关于miRNA-200b与宫颈癌的关系，研究较少。张占薪等[9]发现miRNA-200b在宫颈癌组织中的表达较正常宫颈组织显著增高，推测其可能为癌基因，促进宫颈癌的发生发展。miRNA23b现也在部分肿瘤中有所发现，但其在不同肿瘤中表达强弱不一。Gottardo等[10]对25例膀胱上皮细胞癌组织标本进行检测，以2例正常人膀胱组织为对照，发现miRNA-23b明显上升。Ryazansky等[11]发现在慢性淋巴瘤患者组织中，miRNA-23b也有不同程度上升。Kutay等[12]对Fisher小鼠给予缺乏甲基的食物喂养54周后，小鼠肝脏出现癌变，与正常肝脏组织比较，miRNA-23b明显上升。而Lui等[13]研究发现，在宫颈癌患者中，miRNA-23b呈下降表达。本研究发现经新辅助化疗后,宫颈癌组织中miRNA-23b的表达下调,也从一定程度上证明了miRNA-23b与宫颈癌的相关性，但新辅助化疗与其表达是否具有确切的关系仍待进一步验证。

本研究还发现，新辅助化疗后，宫颈癌组织中miRNA-99b和miRNA-143较治疗前明显上升。吴维光等[14]研究发现，通过上调miR-99b表达可抑制宫颈癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡。并推测其作用靶分子为CDC25A蛋白，通过抑制CDC25A蛋白表达，促进宫颈癌细胞凋亡。因此认为miR-99b有可能成为宫颈癌治疗的靶基因。而miRNA-143则可在前列腺及卵巢等正常组织中高表达，同时它是直肠癌、膀胱癌、胃癌等多种肿瘤的抑癌基因。Noguchi等[15]通过对膀胱癌T24细胞的研究发现，增强miRNA-143表达可下调T24细胞的增殖,其机制可能是miRNA-143通过抑制靶蛋白ERK5和Akt表达，促进细胞凋亡。

本研究在芯片结果的基础上经过查阅文献，初步筛选出上述5个可能与肿瘤发生发展相关的miRNA。下一步拟通过进一步筛选可能与宫颈癌相关的miRNA，并通过实时定量PCR等技术验证芯片结果与宫颈癌关系来确定新辅助化疗相关的miRNA及其靶分子，明确其可能的分子机制。

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Differential expression of miRNA in neoadjuvant chemotherapy for cervical cancer

Li Lianxiang, Chen Lihong

(The People’s Hospital of Shaanxi Province, Xi’an 710068, China)

Objective It is to observe the differential expression profile correlated with neoadjuvant chemotherapy for cervical cancer, thus to clear and definite the molecular mechanism of these expressions.Methods Three pairs of samples (all were cervical cancer that were stage IIb well-differentiated squamous cell carcinoma) were selected from tumor tissue in the patients with cervical cancer before and after neoadjuvant chemotherapy. The differential expression profile correlated with neoadjuvant chemotherapy was found out after initial screening with Agilent microRNA chip detection. Results 56 miRNA of differential expression were found out after initial screening, in which 29 miRNA accounting for 52% were over-active and 27 miRNA accounting for 48% were under-active after neoadjuvant chemotherapy. Finally 5 miRNA that were related with cervical cancer were screened combined with literature. Conclusion Neoadjuvant chemotherapy is related with the differential expression of 5 miRNA.

cervical cancer; neoadjuvant chemotherapy; miRNA

李连香(1977—)，女，硕士，主治医师，从事妇产科工作。

陈丽宏，E-mail：lihongchen29@163.com

陕西省社发攻关资助项目(2010K01-156)

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.02.004

R737.33

A

1008-8849(2014)02-0122-04

2013-06-15