实验性结肠炎大鼠结肠上皮细胞凋亡与肠道通透性的研究

袁柏思，周淑萍，路又可，汪芳裕

(1. 南京军区南京总医院，江苏 南京 210002；2. 安徽省淮南市第一人民医院，安徽 淮南 232007)

论 著

实验性结肠炎大鼠结肠上皮细胞凋亡与肠道通透性的研究

袁柏思1，周淑萍2，路又可1，汪芳裕1

(1. 南京军区南京总医院，江苏 南京 210002；2. 安徽省淮南市第一人民医院，安徽 淮南 232007)

目的 探讨右旋葡聚硫酸钠(DSS)溶液诱导建立的溃疡性结肠炎(UC)大鼠模型肠上皮细胞凋亡改变与肠黏膜屏障的关系。方法 将18只健康SD大鼠随机分成2组：UC组12只和NC组6只，UC组大鼠自由饮用DSS溶液(浓度为40 g/L) 7 d，建立急性UC模型，NC组正常饮水，第8天处死大鼠，留取结肠标本，HE 染色观察结肠黏膜病变，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测UC大鼠结肠上皮细胞凋亡数。结果 TUNEL细胞凋亡检测结果显示，UC组大鼠结肠上皮细胞凋亡数量明显高于NC组，细胞凋亡数目和肠黏膜损伤的程度呈正相关。结论 DSS诱导的UC大鼠肠上皮细胞凋亡增加，相邻细胞间的间隙增大，导致肠黏膜屏障受损，从而使肠道通透性增高。

溃疡性结肠炎；肠黏膜屏障；通透性；凋亡

溃疡性结肠炎(UC)是一种主要累及肠道黏膜层，以弥漫性黏膜炎症和溃疡性病变为特点的慢性非特异性肠炎。细胞凋亡失调可导致肿瘤、自身免疫性疾病的发生，细胞凋亡对UC的肠道黏膜层损伤也有着重要的影响。本研究通过测定右旋葡聚硫酸钠(DSS)溶液诱导建立的UC大鼠模型肠上皮细胞凋亡情况，探讨与肠黏膜屏障的关系，进一步了解UC的发病机制。

1 实验资料

1.1 动物 健康清洁级雄性SD大鼠18只，3月龄，体质量(200±20)g，南京军区南京总医院比较医学科提供。大鼠饲养于恒温((20±2)℃)、恒湿((45±5)%)环境，6只/笼，适应性喂养1周后开始造模。

1.2 DSS诱导UC大鼠模型制作 18只健康SD大鼠随机分成2组：UC模型组(UC组，n=12)和正常组(NC组，n=6)，UC组大鼠自由饮用DSS溶液(浓度为40 g/L)7 d，自由进食，建立急性UC模型，NC组正常饮水，每天测定大鼠体质量，收集粪便，用动物隐血试剂盒测定便隐血，评估疾病活动指数。第8天处死大鼠，留取结肠标本，HE染色观察结肠黏膜病变，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测UC大鼠结肠上皮细胞凋亡数。

1.3 细胞凋亡的检测 利用罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测结肠上皮细胞凋亡数。具体操作步骤：①玻片脱蜡2～3 h，用二甲苯浸洗2次，每次5 min；②用梯度乙醇(100%，95%，90%，80%，70%)各浸洗1次，每次3 min；③PBS漂洗2次；④在21～37 ℃用Proteinase K工作液处理组织15～30 min；⑤PBS漂洗2次；⑥制备TUNEL反应混合液，用50 μL TDT+450 μL荧光素标记的dUTP液混匀；反应10 min；⑦玻片干后，加50 μL TUNEL反应混悬液于标本上，加盖玻片在暗湿盒中反应1 h；⑧PBS漂洗3次；⑨加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450 nm)，凋亡的细胞呈现高度点状白色荧光，正常细胞呈现均匀绿色荧光。

1.4 大鼠肠道通透性评估 三氯蔗糖是一种人工合成的二糖，通过肠道后不会发生变化，能够抵抗结肠细菌分解，一旦进入血管内腔，便完整地排泄至尿液中；甘露醇在正常情况下基本不从肠道吸收，因而在尿中含量很少。当通透性增高后，它们将从肠道吸收入血，然后从尿中排出，尿中的含量就会升高。高压液相色谱法检测大鼠尿液中三氯蔗糖及甘露醇排泄量可用于结肠通透性的评估。

1.5 统计学处理 计量数据以均数±标准差表示。应用SPSS 11.5软件进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组大鼠肠黏膜组织HE染色 成功诱导实验性大鼠UC模型后，显微镜下见到肠黏膜上皮细胞层完整性受到破坏，伴有炎性细胞浸润，隐窝扭曲变形及黏膜下水肿，见图1。NC组大鼠结肠组织未见明显的病理改变，见图2。

图1 UC组大鼠结肠黏膜HE染色表现(×400)

2.2 2组大鼠肠道通透性的变化 UC组大鼠尿液中的三氯蔗糖总排出量明显高于NC组((0.69±0.13)mg/L vs (0.12±0.095)mg/L，P<0.05)，甘露醇的排泄量在UC组显著增加((0.016±0.002 2)mg/L vs (0.017±0.005 4)mg/L，P<0.05)。

2.3 2组大鼠结肠上皮细胞凋亡检测情况 采用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测大鼠结肠上皮细胞凋亡，荧光显微镜可检测到凋亡的细胞出现高度点状白色荧光，而正常细胞呈现均匀绿色荧光。在成功诱导大鼠UC模型后，肠道黏膜层、黏膜下层及结肠隐窝上皮细胞均有凋亡现象，其结肠上皮细胞凋亡数量明显高于NC组。见图3及图4。

图2 NC组大鼠结肠黏膜HE染色表现(×400)

图3 NC组大鼠上皮细胞凋亡情况(×400)

图4 UC组大鼠上皮细胞凋亡情况(×400)

3 讨 论

UC虽然发生机制和临床表现不完全相同，但其共同特征是肠道通透性增加，肠道通透性增加的程度提示肠黏膜屏障功能受损的轻重。无论从实验研究，还是UC患者的临床标本均证实肠黏膜屏障功能受损是UC发生发展中的关键环节。先前的研究结果表明，肠黏膜屏障功能的维持还依赖于肠上皮细胞的增殖/凋亡调节[1]。为进一步探讨肠上皮细胞凋亡和肠黏膜屏障功能的关系，本实验采用罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序检测UC大鼠结肠上皮细胞凋亡数。在成功诱导大鼠UC模型后，UC组结肠上皮细胞凋亡数量明显高于NC组，UC组肠道病变区域或其附近的区域，结肠隐窝上皮细胞均有凋亡现象。而且本研究结果显示，通过检测能够反映结肠通透性增加的糖分子探针三氯蔗糖，发现UC大鼠的肠黏膜通透性明显增加，而肠黏膜通透性的增加反映的是肠黏膜损伤的程度，因此，本研究提示肠道通透性的增加和结肠上皮细胞凋亡数量呈正相关。在UC患者中还发现，结肠隐窝部位上皮细胞凋亡明显增加[2]，活动期UC患者结肠黏膜上皮细胞凋亡数是对照组的32倍[3]，局部大量上皮细胞的凋亡会导致黏膜屏障的破坏，使局部炎性细胞浸润增多，进一步加重黏膜损伤[4]。据此推测UC发病时，大量的肠黏膜上皮细胞发生凋亡，使凋亡细胞相邻的上皮细胞不能有效地封闭凋亡细胞所留下的空间，导致肠黏膜屏障受损，从而使肠道通透性增高。此外，本研究中所采用的免疫荧光检测细胞凋亡，能够更清楚的显示和评估凋亡细胞的数目、所累及的黏膜深度，是对之前研究细胞凋亡方法的改进。

综上所述，DSS诱导的UC大鼠肠道黏膜屏障受损，其肠道通透性增加，可能是由于肠上皮细胞凋亡增加破坏肠黏膜屏障功能所致。

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Study on the relationship between colonic epithelial cell apoptosis and intestinal permeability in rats with experimental colitis

Yuan Bosi1, Zhou Shuping2, Lu Youke1, Wang Fangyu1

(1. Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command of PLA, Nanjing 210002, Jiangsu, China; 2.The First People's Hospital of Huainan City, Huainan 232007, Anhui, China)

Objective It is to explore the relationship between intestinal epithelial cell apoptosis and the intestinal mucosal barrier in rats with DSS-induced experimental ulcerative colitis(UC).Methods Eighteen Sprague-Dawley rats were assigned randomly to UC group (n=12) and normal control (NC) group (n=6). Rats in UC group were fed with 4% DSS for 7 days to establish acute UC model. Rats in NC group were fed with tap water. And then the rats were anesthetized and sacrificed on the eighth day, and the colon samples were collected. Colonic mucosal lesions were observed by HE staining, and the number of apoptotic cells was detected by TUNEL situ cell death detection kit in the rats with DSS-induced colonic epithelium.Results The results of in situ cell death detection kit-POD for detecting the number of apoptotic cells showed that the number of epithelial cell apoptosis was significantly higher in the UC group than that of the normal control group, and there was a positive correlation between the number of apoptotic and intestinal mucosal damage level.Conclusion In the DSS-induced UC rats, the intestinal epithelial cell apoptosis increased and its adjacent cell gap widen which caused damage of intestinal mucosal barrier, thus lead to the increasing of intestinal permeability.

ulcerative colitis; intestinal mucosal barrier; permeability; apoptosis

袁柏思(1980—)，男，主治医师，研究方向为消化系疾病。

汪芳裕，E-mail: wangfangyu65@yahoo.com.cn

国家自然科学基金资助项目(81070289)

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.02.001

R-332

A

1008-8849(2014)02-0115-03

2013-07-15