热炮制对珍珠寡肽类化学成分的影响

任伯颖，康馨元，刘 冬，代婷婷，张 辉，孙佳明

(长春中医药大学，长春 130117)

珍珠为珍珠贝科动物马氏珍珠贝pteriamartensii(Dunker)、蚌科动物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)或褶纹冠蚌Cristariaplicata(Leach)等双壳类动物[1]由于内分泌作用而生成的含碳酸钙的矿物珠粒。珍珠含有人体必需的氨基酸、30多种微量元素、牛磺酸、丰富的维生素及肽类[2-4]。中医认为其具有安神定惊、明目去翳、解毒生肌等功效，陶弘景在《本草经集》中说，珍珠“有治目肤翳，止泄”等作用。珍珠可研粉、生用，也可炮制[5]使用，王英等[6]研究发现，珍珠经炮制后与珍珠未经炮制比较镇静催眠作用有所差异，但是如何炮制珍珠才能更好的发挥珍珠的药用价值[7-8]成为珍珠药学研究中的又一问题。本文基于肽键热振荡理论中热振荡会对肽键三维空间结构造成改变，使其肽类化学成分的组成发生变化，进而影响其疗效的观点出发,对珍珠及其150，600，900 ℃的热炮制品的高效液相色谱[9-11]数据进行比较，初步探讨不同温度热炮制对珍珠中寡肽类化学成分的影响，为珍珠的加工炮制现代技术规范奠定基础。

1 实验材料

1.1 药材 珍珠为安徽省太湖三角帆蚌Hyriopsis cumingii(Lea)所产的珍珠。

1.2 仪器 BS110S电子天平,东京理化FD-1000冻干机，电热恒温水浴锅，SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，CR20B2型冷冻高速离心机，闪式蒸发浓缩系统，Millipore超滤仪,固相萃取(SPE)小柱，Agilent 1100HPLC。

2 实验方法

2.1 样品的制备 珍珠生品的制备：将珍珠粉碎过40～60目筛。珍珠热炮制品的制备：将珍珠生品在烘箱中分别于150，600，900 ℃烘烤1 h,取出，晾凉即得。珍珠及其热炮制品总寡肽的制备：取珍珠生品及其热炮制品各100 g,分别加入3倍量的水超声2 h后，放于搅拌器下浸泡12 h，次日4 ℃下12 000 r/min离心30 min，双层滤纸抽滤得上清液,0.45 μm微孔滤膜滤过；再用超滤仪截流分子量1 KDa以下的提取液，冻干[12]。取冻干粉0.25g加入双蒸馏水溶解后，经C8固相萃取柱纯化,先2 mL蒸馏水淋洗后再用2 mL 50%甲醇洗脱，洗脱液过0.45 μm滤膜，备用。

2.2 色谱条件 XAqua C8色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)，0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～10 min，A相10%→15%；10～20 min，A相15%→45%。进样量为10 μL，流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，洗脱时间为20 min，检测波长280 nm。

3 实验结果

3.1 珍珠及其热炮制品总寡肽的高效液相色谱图中色谱峰数目的比较 实验结果表明，乙腈/0.1%的甲酸水溶液二元线性梯度洗脱，珍珠及其热炮制品中的寡肽类化学成分得到了较理想的分离效果，见图1。

A:生品；B:150 ℃烘烤品；C:600 ℃烘烤品；D:900 ℃烘烤品图1 不同温度热炮制珍珠寡肽类成分的高效液相色谱图

通过4种样品高效液相色谱图的比较分析，发现对珍珠及其热炮制品中均含2个共有色谱峰，分别为峰4和峰8。但是各样品的高效液相色谱图中所含色谱峰数目并不一致，这说明它们含有的寡肽类化学成分的种数量各不相同。其中生品和900 ℃烘烤品中所含色谱峰数目最少，为4个；而150 ℃和600 ℃烘烤品中所含色谱峰数目最多,分别为7个和9个。这说明珍珠在热炮制过程中，随着炮制在一定范围内(150～600 ℃)随着温度的提高,所得到的寡肽类化学成分的数目也随之增加。但是当温度高于一定范围(≥900 ℃)，其中的寡肽化学成分多数遭到破坏，未能提取得到。

3.2 珍珠及其热炮制品总寡肽的高效液相色谱图中色谱峰峰面积的比较 珍珠的热炮制品中的共有峰(峰4和峰8)的峰面积相对于珍珠生品中对应的色谱峰的峰面积均有不同程度的减少，这说明珍珠的热炮制品中寡肽类化学成分含量相对于珍珠生品有不同程度的下降，见表2。

表2 珍珠生品及其热炮制品中寡肽类化学成分的色谱峰峰面积

编号保留时间/min紫外特征Uvmax峰面积生品150 ℃600 ℃900 ℃ 1 7.697270 — — 6.217.7 2 8.036280 34.6 — 90.331.6 3 8.575280 12.9 15.1 8.7 — 410.343260372.5 37.229.7 23.3 510.809260 — —12.24 — 611.146260 — 8.8 12.4 — 711.581260 —206.7189.9 — 815.134260270.8 128 68.164.6 915.208260 — — 46.8 —1016.146260 — 73.9 — —

4 结论

通过珍珠及其热炮制品总寡肽高效液相色谱峰面积数据的分析,发现4种样品中共有峰峰4和峰8的峰面积随着热炮制温度的升高而逐渐下降。150，600，900 ℃烘烤下的珍珠高效液相色谱图的峰4的峰面积依次下降为生品的9.99%、7.97%和6.26%，而150，600,900 ℃烘烤下的珍珠中高效液相色谱图的峰8的峰面积依次下降为生品的47.3%、25.1%和23.9%。由此可以看出峰4和峰8对应的化学成分的热稳定性有一定差异，即在相同的肽键热振荡程度下,肽键的牢固程度峰8大于峰4。故而在热炮制过程中峰8对应的化学成分保留的相对于峰4要多出3到4倍。

在一定范围内(150～600 ℃)随着热炮制温度的提高,珍珠及其热炮制品总寡肽高效液相色谱图中峰4和峰8的峰面积随之逐渐下降。同时热炮制品中的寡肽类化学成分的数目却逐渐增加，这有可能峰4或峰8对应的寡肽类成分中肽键在热振荡的作用下产生裂解，新生成了更多的更小分子量的寡肽类化学成分。但是当温度高于一定范围(≥900 ℃)，其中的寡肽化学成分的肽键由于热振荡作用过强烈而多数遭到破坏，未能提取得到。

[1]国家药典委员会.中国药典[M].北京:化学工业出版社,2010:215-216.

[2]翁林福.淡水珍珠和海水珍珠化学成分的分析比较[J].中国药学杂志,1989(5):276-278.

[3]夏静芬,钱国英,陈亮,等.珍珠粉和贝壳粉的化学成分和结构特征分析[J].化学研究与应用,2010,22(11):1467.

[4]沈忠昀,康玉霜,陈纪东,等.珍珠粉与三角帆蚌贝壳粉的物质组份区分[J].计量与测试技术,2010,37(12):69-71.

[5]白剑飞,晏育明,崔学义.珍珠炮制工艺研究概述[J].黑龙江医药,2001(2):118-120.

[6]常福厚,王英,范蕾.珍珠炮制前后对小鼠镇静催眠作用比较[C]//中国药理学会第九次全国会员代表大会暨全国药理学术会议论文集.武汉:中国药理学会,2007:1.

[7]张锦卫,竹剑平.珍珠粉抗疲劳作用的实验研究[J].中国医院药学杂志,2005(4):358-359.

[8]韩 ,张春椿,熊耀康.珍珠粉临床应用的最新研究进展[J].中医学报,2011,26(7):835-837.

[9]李影,孙佳明,杜鹤,等.炮制方法对珍珠母总蛋白质含量及凝胶电泳特征谱带的影响[J].吉林中医药,2013,33(12):1250-1252.

[10]晏桂敏,李小龙,曾苏,等.珍珠粉中氨基酸的高效液相色谱指纹图谱研究[J].现代药物与临床,2011,26(6):490.

[11]张芩.合浦珠母贝贝壳形成相关蛋白及基因的研究[D].北京:清华大学,2006.

[12]刘冬,代婷婷,查荣博,等.珍珠母镇静催眠作用及其不同炮制品对小鼠脑内5-羟色胺浓度的影响[J].吉林中医药,2014,34(1):61-63.