花生衣总黄酮纯化工艺研究

2014-08-09朱丽红柳小莉唐志书郭东艳

吉林中医药 2014年9期

白甫，朱丽红，柳小莉，唐志书，郭东艳

(陕西中医学院药学院，陕西咸阳 712046)

花生衣为豆科植物落花生(ArachishypogaeaL.)的种皮，味甘、微苦、性平，具有健脾和胃、养血止血、散瘀消肿之功。主要含有脂质、鞣质、甾醇、花生苷、花生衣色素、儿茶素等成分[1]，其中主要色素成分为黄酮类化合物，另外还含有花色苷、黄酮、二氢黄酮等。现代药理研究表明，花生衣的95% 乙醇总提物对正常小鼠及凝血障碍小鼠均有明显的止血作用[2]。此外花生衣还具有抗纤维蛋白溶解、促进骨髓制造血小板、缩短出血时间、加强毛细血管的收缩、调整凝血因子缺陷等功能[3]。临床观察结果表明花生衣汤能提高化疗周期患者的血红蛋白[4]、显著提高肝硬化患者的血小板数[5]及具有防止化疗引起血小板降低的作用[6]。近年来广泛用于胃、肠、肺、子宫等内脏出血，及放化疗引起的血小板减少症等。但是查阅大量文献资料发现，有关花生衣总黄酮纯化工艺研究较少，因此本文拟采用大孔树脂纯化法对花生衣总黄酮的纯化工艺进行优化，为后期进一步制剂开发奠定基础。

1 实验材料

1.1 材料花生衣购于西安盛兴中药饮片有限公司，经陕西中医学院王继涛老师鉴定为豆科植物落花生(ArachishypogaeaL.)的种皮；芦丁对照品(中国生物制品检定所，批号100080-200707),水为双蒸馏水，试剂均为分析纯；D101型大孔树脂、HPD300型大孔树脂、HPD100型大孔树脂、AB-8型大孔树脂(西安蓝晓科技有限公司)。

1.2 仪器 WJN-50多功能真空浓缩机(韩国)，L-520型离心机(湖南赛特湘仪离心机有限公司)，RE-52-05旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),SB3200DT-超声波清洗机(宁波)。

2 实验方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取在105 ℃干燥至恒重的芦丁对照品10.0 mg，置50 mL量瓶中，加20 mL甲醇，超声处理溶解，再用甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液(0.20 mg/mL)，放入冰箱备用。

2.1.2 供试品溶液的制备精密移取样品液1 mL至50 mL量瓶中,加50%甲醇至刻度。精密吸取0.5 mL至25 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 总黄酮的最大吸收波长的确定分别对对照品溶液和供试品溶液进行最大吸收波长扫描，扫描范围200～800 nm，结果均在510 nm处有强吸收峰。

2.1.4 标准曲线的制备精密量取对照品溶液2，3，4，5，6，7 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，参照紫外-可见分光光度法(附录ⅤA)在510 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线。得回归方程Y=11.339X-0.035，R2=0.999 7，结果表明芦丁在0.016～0.056 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.5 样品中总黄酮含量测定精密吸取供试品溶液1 mL，加水至6.0 mL，按2.1.4项下加5%亚硝酸钠溶液1 mL起，至在510 nm波长处测定吸光度，记录吸光度，计算总黄酮含量。

2.2 树脂型号的筛选

2.2.1 母液的制备称取花生衣1 kg，加15倍量40%乙醇提取3次，每次30 min,滤过合并提取液，浓缩，回收乙醇至无醇味，加蒸馏水定容至2 000 mL，备用。

2.2.2 样品溶液的制备取母液100 mL，加蒸馏水定容至250 mL，制成浓度为0.2 g/mL样品。

2.2.3 大孔吸附树脂的预处理用95%的乙醇浸泡24 h，蒸馏水洗至无醇味，备用。

2.2.4 静态吸附将经过预处理的4种大孔树脂(D101、HPD100、HPD300、AB-8)去除表面水后，各取3 g，分别置于具塞锥形瓶中，再分别移取0.2 g/mL的样品溶液50 mL加入装有树脂的具塞锥形瓶中，振摇8 h，静置16 h，过滤，得残留液。测定总黄酮含量A1。树脂加入50%的乙醇50 mL,振摇8 h，静置16 h，过滤，得到洗脱液，测定总黄酮含量A2。

2.2.5 液残留液及洗脱液中总黄酮的测定母液中总黄酮的测定：取1 mL样品溶液，用甲醇定容至25 mL，取出0.4 mL，加入显色剂，定容至25 mL。测定母液中的总黄酮含量A3,结果见表1。

未被吸附的残留液中与洗脱液中总黄酮含量的测定：精密吸取残留液与洗脱液各1 mL，用甲醇定容至25 mL，取出0.8 mL加显色剂定容至25 mL。测定其残留液中总黄酮含量A1，洗脱液中总黄酮含量A2，结果见表1。

吸附率=[(母液含量A3(mg)-残留液中总黄酮含量A1(mg))/母液含量A3(mg)]×100%

解析率=[40%乙醇洗脱下的含量A2/(母液含量A3(mg)-残留液中含量A1(mg))]×100%

表1 静态吸附考察结果

结果表明:AB-8型大孔树脂的吸附量、解吸量低于其他3种型号树脂，D101的吸附率及解吸率较大，故选择D101树脂。

2.3 树脂纯化条件的考察[7-8]

2.3.1 径高比的选择分别称取预处理过的D101大孔树脂2.4，4.8，7.2，9.6 g,使径高比分别为1∶5,1∶10,1∶15,1∶20。树脂生药比为1∶1。分别取适量的样品溶液稀释至浓度为0.1/mL,加于D101树脂柱上，以3 BV/h的流速进行吸附，先以4 BV水洗脱后，再用4BV 70%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定水洗液和醇洗液中总黄酮的含量,计算吸附率及洗脱率。结果当径高比为1∶15时,花生衣的吸附率和洗脱率均最大，因此，确定树脂柱的径高比为1:15。

2.3.2 上样药液浓度的选择称取预处理过的D101大孔树脂4份，每份7.2 g，使径高比为1∶15。树脂生药比为1∶1，分别取适量的样品溶液,将样品溶液分别稀释为含生药0.1,0.2,0.3,0.4 g/mL,(原本考察的浓度为0.2，0.4，0.6，0.8 g/mL，但由于浓度到0.4 g/mL时。柱子有些堵，所以将浓度范围定为0.1，0.2，0.3，0.4 g/mL)，加于D101树脂柱上，以3 BV/h的流速进行吸附后，先以4 BV/h水洗脱后，再用4 BV/h 70%乙醇洗脱，收集洗脱液至，计算吸附率及洗脱率。结果见表2。

表2 上样药液浓度的考察结果

在从表中可以看出上样药液浓度为0.1 g/mL时，花生衣中总黄酮的吸附率和洗脱率均最大，因此，确定上样液的药液浓度为0.1 g/mL。

2.3.3 上样药液流速的考察称取D101树脂7 g 4份，分别装柱，径高比为1∶15，取0.1 g/mL的药液50 mL 4份。将4份样品分别按照0.5,1,2,3 BV/h的流速上样，统一按照50 mL水洗量，2 BV/h水洗流速进行水洗除杂,70%乙醇洗脱至盐酸镁粉反应无色。分别收集洗脱，取1 mL用甲醇定容至25 mL，精密量取0.8 mL，加显色剂定容至25 mL。结果见表3。

表3 上样药液流速考察结果

结果表明：上样流速对有效成分的吸附有显著的影响，在2 BV/h的条件下有效成分含量最大，故确定上样流速为2 BV/h。

2.3.4 水洗大孔树脂的考察取已经过预处理的大孔树脂7.2 g装柱(1.1 cm×15 cm，V=3.14×(1.1/2)2×15=14.25)，取上样药液72 mL(0.1 g/mL)药液上样后静置2 h,以流速为2 BV/h的水除去水溶性杂质。以15 mL为单位收集洗脱液，洗至无颜色。以盐酸镁粉反应阴性作为水洗终点，最终确定洗脱用水用量约3 BV。

2.3.5 洗脱剂浓度的确定取已经过预处理的大孔树脂装柱(1.1 cm×15 cm,V=3.14×(1.1/2)2×15=14.25)，取上样药液72 mL(0.1 g/mL)。药液上样后静置2 h，用3 BV水洗去杂质后,依次用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液各3 BV进行梯度解吸，分段收集解吸液。测定并计算解吸液中黄酮的含量，绘制解吸曲线，结果见图1。

图1 洗脱剂浓度考察结果

由图可以看出，黄酮在60%时基本解析完毕，但由于在解吸的过程中乙醇会挥发,所以选择70%的乙醇为洗脱剂。

2.3.6 洗脱剂用量的考察取已经过预处理的大孔树脂装柱(1.1 cm×15 cm，V=3.14×(1.1/2)2×15=14.25)，取上样药液72 mL(0.1 g/mL生药)药液上样后静置2 h，用3 BV水洗去杂质后，用70%乙醇进行洗脱，每1 BV收集1份，测定洗脱液中总黄酮的含量，绘制解析曲线。结果见图2。

图2 洗脱液用量考察试验结果曲线

结果表明：当洗脱剂用量达到3 BV时，洗脱液中的黄酮含量已很低。所以选择洗脱剂用量为3 BV。

2.4 花生衣大孔树脂的工艺参数验证按照优选的工艺条件，选用D101型大孔树脂，上样药液浓度为0.1 g/mL，上样速度为2 BV/h，树脂径高比为1∶15，洗脱时先用3 BV水洗，再用3 BV 70%乙醇洗脱，收集洗脱液，干燥，计算总黄酮含量。结果总黄酮平均含量为66.12%(n=3)。表明该纯化工艺稳定、合理、可行。