肝脂酶基因启动子区-514C/T多态性与2型糖尿病 血脂代谢和胰岛素抵抗的相关性研究

石柔，雷又鸣，李会芳，宋滇平

论著·临床

肝脂酶基因启动子区-514C/T多态性与2型糖尿病 血脂代谢和胰岛素抵抗的相关性研究

石柔，雷又鸣，李会芳，宋滇平

目的探讨肝脂酶(HL)基因启动子区-514C/T多态性与2型糖尿病(DM) 血脂代谢和胰岛素抵抗(IR)的相关性。方法采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)结合DNA测序技术，对2型DM患者284例(DM组)和糖耐量正常的健康对照者197例(NC组)进行HL -514C/T多态性检测，并观察该基因多态性与血脂代谢、IR的相关性。结果(1)DM组患者C/C基因型和C/T+T/T基因型频率分别为39.2%和60.8%，等位基因C和T频率分别为64.5%和35.5%，NC组分别为32.7%、67.3%和63.2%、36.8%，2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)DM组中C/T+T/T基因型患者三酰甘油水平为(2.93±1.37)mmol/L, C/C基因型患者为(2.07±1.82)mmol/L，2组比较差异有统计学意义(P<0.05),余指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(3)DM组中C/T+T/T基因型患者与C/C基因型患者IR相关指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(4)Logistic回归分析表明，DM组中HL-514C/T基因多态性、BMI与TG异常呈正相关(OR=3.042，95%CI 1.265～7.317；OR=2.600，95%CI 1.520～4.447，P均<0.05)。结论HL-514C/T基因多态性可能与2型DM的发生无相关性，与2型DM患者IR亦无关，但是HL-514T等位基因可能是2型DM患者发生高TG血症的危险因素。

肝脂酶基因；糖尿病；血脂代谢；胰岛素抵抗；分子遗传学

脂代谢紊乱和胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病(DM)及其并发症的原发性病理生理过程。高脂血症既是IR的结果，也是IR的主要致病因素，二者互为因果[1]。肝脂酶(HL)是脂蛋白代谢的关键酶之一，其主要功能是参与高密度脂蛋白的重构和乳糜微粒残骸、低密度脂蛋白的代谢以及胆固醇的逆向转运。HL基因启动子区单核苷酸基因多态性与HL活性有关，并影响血脂谱。现探讨HL-514C/T多态性与2型DM血脂代谢及IR的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2011年3月—2012年11月于我院门诊就诊或住院2型DM患者284例(DM组)，均符合1999年WHO 2型DM诊断标准；排除标准：急性应激状态、严重肝脏及肾脏疾病、其他内分泌系统疾病等影响血脂代谢的疾病。284例中男146例，女138例，年龄37～75(61.1±10.7)岁，病程(3.6±3.1)年，其中有家族史者68例，无家族史者216例。患者均口服降糖药治疗且至少1个月内未使用调脂药。选择同期在我院体检糖耐量正常且无糖尿病家族史的健康者197例为健康对照组(NC组)，男102例，女95例，年龄32～72(59.4±11.6)岁。2组均为中国云南地区居住的无血缘关系的汉族人。2组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 观测方法

1.2.1 临床及生化指标检测： 记录2组对象的性别、年龄、病程、家族史等情况。测量身高、体质量、腰围、臀围并计算体质量指数(BMI)和腰臀比(WHR)。禁食12 h后次日晨采静脉血3 ml，全自动生化分析仪测定空腹血糖(FPG)及餐后2 h血糖(2hPG)、总胆固醇(TC)、三酰甘油 (TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，用微柱法测定糖化血红蛋白(HbA1c)。用放免法检测空腹胰岛素(FINS)水平，用稳态模型(HOMA)方法，计算胰岛素抵抗指数：HOMA-IR= (FPG×FINS)/22.5。

1.2.2 HL基因启动子-514C/T多态性分析： 用酚/氯仿法提取外周血白细胞DNA作为模版。以寡核苷酸5′-GGATCACCTCTCAATGGGTC-3′为上游引物，5′-GGAAATTCTGCCAAAGGTCGG-3′为下游引物(大连宝生物工程有限公司)进行PCR。PCR体系:DNA模板2 μl,10×Buffer(MgC12-Free) 5 μl, MgC12(25 mmol/L)4 μl，DNTP(2.5 mmol/L)1.2 μl，上下游引物(20 μmol/L)各1 μ1，Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.8 μl，加双蒸水至50 μl。PCR循环温度:95℃预变性5 min，然后按95℃变性45 s、60℃退火45 s、72℃延伸45 s的循环条件扩增，共35个循环，最后72℃延伸5 min。扩增产物以限制性内切酶Nla III(大连宝生物工程有限公司) 37℃酶切过夜。酶切产物经4 %的琼脂糖凝胶电泳及溴化乙锭染色后，观察结果。PCR产物纯化后交由大连宝生物工程有限公司进行DNA测序加以确证。

2 结 果

2.1 HL基因启动子- 514C /T基因型电泳图谱 扩增产物经限制性内切酶Nla III消化后，产生3种酶切结果：T/T基因型可见241bp的1条片段，C/T基因型可见306bp、241bp 2条片段，C/C基因型只有306bp 1条片段。见图1。

注：M.Marker；1、2、3.C/C基因型；4.C/T基因型；5.T/T基因型

2.2 扩增产物DNA测序结果 扩增产物片断为306bp，将产物测序并与GeneBank中HL基因启动子区-514位点C、T基因系列进行比较，与相应系列完全一致。见图2。

2.3 基因型频率和等位基因频率比较 对群体资料作Hardy-Weinberg平衡吻合度检验，符合Hardy-Weinberg平衡定律(P均>0.05)；NC组和DM组之间基因型和等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组HL基因型频率和等位基因频率

2.4 DM组中HL不同基因型间临床指标比较 DM组中C/T+T/T基因型与C/C基因型携带者相比TG升高(P<0.05)，其余指标差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 DM不同基因型间临床指标比较

注:与C/C基因型比较，aP<0.05

注：A.C/C型；B.C/T型；C.T/T型

2.5 DM组不同HL基因型间胰岛素抵抗相关指标比较 尽管C/T+T/T 基因型患者FINS、HOMA-IR 水平较C/C基因型患者高，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 DM不同基因型间胰岛素抵抗相关指标比较

2.6 Logistic回归分析 在DM组中以TG异常与否作为因变量(以TG ≥1.7 mmol/ L为异常)，以HL基因型、性别、年龄、BMI、WHR、FPG、2hPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、TC、HDL-C和LDL-C作为自变量，进行Logistic回归分析，结果提示：DM组中HL-514C/T基因多态性、BMI与TG异常呈正相关。见表4。

3 讨 论

在2型DM的发生、发展过程中常伴随着不同程度的脂代谢异常。人类肝脂酶是一种重要的脂肪酶，能水解各种脂蛋白内的三酰甘油和磷脂，释放出游离脂肪酸，在乳糜粒残骸的清除、LDL的形成及TC的逆向转运过程中起重要作用。不仅HL的合成和活性异常能引发血脂异常，而且HL基因启动子区域多态性也会影响其生理功能，从而影响脂代谢[2]。目前大部分的研究都集中在HL- 514C/ T多态性对脂代谢的影响上，而针对糖尿病及其相关危险因素的研究较少。

表4 Logistic回归分析结果

本研究提示在中国汉族人中HL-514位点存在3种基因型，即C/C型、C/T型和T/T型，T等位基因频率在DM组和NC组中分别为0.368和0.355。HL- 514C/T基因型及等位基因频率在DM组与NC组之间比较差异无统计学意义。提示HL-514C/T多态性与2型DM的发生无相关性，与大多数报道相一致[3，4]。

既往多项临床研究均表明HL- 514T等位基因与血浆HDL-C及TG的浓度增加有关[5，6]。最近国内外学者也报道在男性冠心病患者中，具有HL-514C/T和T/T基因型患者的HDL-C水平明显高于C/C组，提示该基因多态性与血脂的关系可能受性激素水平的影响[5，7]。与此同时来自美国的一项研究提出不同观点，他们发现在肥胖女性中HL-514C/T多态性独立影响HDL-C水平[6]。本研究发现在DM组中C/T+T/T基因型与C/C基因型携带者相比TG升高，但没有发现HL-514C/T多态性与HDL-C有关。研究结果的不同，分析其原因可能是HL-514C/T多态性与脂代谢的关系受种族、地域、生活方式、性别等多重因素的影响。Logistic回归分析显示：HL-514C/T基因多态性、BMI与TG异常呈正相关，提示 HL-514T等位基因可能是2型DM患者发生高TG血症的遗传危险因素。同时Logistic回归分析结果还显示超质量和肥胖可能是2型DM患者发生高TG血症的危险因素，这可能与肥胖引发IR，而IR又是2型DM和脂代谢紊乱发生的始动因素有关[8～12]。

由于脂代谢紊乱与IR密切相关，HL基因多态性与IR的关系也开始受到关注。Yasuyoshi等[13]在日本非糖尿病人群中发现，HL-514T等位基因携带者有较高水平的FINS和HOMA-IR。但本研究发现，在2型DM患者中，C/T+T/T 基因型患者较C/C基因型患者FINS、HOMA-IR水平升高, 但差异均无统计学意义。提示HL-514C/T多态性与2型糖尿病患者胰岛素抵抗无关。究竟这一多态性是否与胰岛素抵抗相关需扩大样本量，严格控制试验条件，进一步深入研究。

综上所述， HL-514C/T基因多态性可能与2型DM的发生无相关性，与2型糖尿病患者胰岛素抵抗亦无关。HL-514T等位基因可能是2型DM患者发生高TG血症的危险因素。但是单一基因的单个位点变化不足以观察整个HL 基因对糖尿病的影响，HL-514C/T 多态性可能不是影响HL活性的惟一因素，将来可对HL 基因启动子、外显子多个位点进一步研究以更好地揭示其与糖尿病的内在联系。

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Associationofhepaticlipasegenepromoterregion514C/Tpolymorphismwithlipidmetabolismandinsulinresistanceintype2diabetesmellitus

SHIRou*,LEIYouming,LIHuifang,SONGDianping.

*DepartmentofEndocrine,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China

SONGDianping，E-mail:drsongdp@126.com

ObjectiveTo investigate the correlation among the hepatic lipase (HL) gene promoter 514C/T polymorphism, type 2 diabetes (DM) lipid metabolism and insulin resistance (IR).MethodsApplication the restriction fragment length polymorphism analysis of polymerase chain reaction (PCR-RFLP) combined with DNA sequencing technology, 284 cases of type 2 DM patients (DM group) and normal glucose tolerance in 197 healthy subjects (group NC) were enrolled and underwent for HL-514C/T polymorphism detection, and to observe the correlation between the gene polymorphism, serum lipid metabolism and IR.Results(1) The patients in the DM group with C/C and C/T+T/T genotypes frequencies were 39.2% and 60.8%, C and T allele frequencies were 64.5% and 35.5%, NC group were 32.7%, 67.3% and 63.2%, 36.8%, 2 groups had no significant difference (P>0.05). (2) The patients with C/T+T/T genotype three triglyceride level of DM group was (2.93±1.37) mmol/L, C/C genotype were (2.07±1.82) mmol/L, there was significant difference between the 2 groups (P<0.05), the difference of rest indices were not statistically significant(P>0.05).(3)The differences of rele-vant indices of C/T+T/T genotype and C/C genotype patients' IR were not significantly (P>0.05). (4) Logistic regression analysis showed that, DM group's HL-514C/T gene polymorphisms, BMI were positively correlated with TG anomalies (OR=3.042, 95%CI 1.265-7.317；OR=2.600, 95%CI 1.520-4.447,P<0.05).ConclusionThe HL-514C/T gene polymorphism may had negative correlation with type 2 DM, as well with IR in type 2 DM, while the HL-514T allele may be a risk factor for patients with type 2 DM had high levels of TG.

Hepatic lipase gene; Diabetes; Lipid metabolism; Insulin resistance;Molecular genetics

650032 昆明医科大学第一附属医院内分泌二科(石柔、宋滇平、李会芳)，干疗科(雷又鸣)

宋滇平，E-mail:drsongdp@126.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.07.013

2014-02-19)