洛伐他汀联合降钙素治疗骨质疏松大鼠骨折的效果分析

曹国龙 刘小坡 冯云波 田发明

洛伐他汀联合降钙素治疗骨质疏松大鼠骨折的效果分析

曹国龙1刘小坡1冯云波1田发明2△

目的探讨洛伐他汀单独或联合降钙素对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响。方法4月龄雌性SD大鼠40只，随机分为正常骨折（A）组、骨质疏松性骨折（B）组、洛伐他汀治疗（C）组、降钙素治疗（D）组和联合治疗（E）组，每组8只。A组行假手术，B、C、D、E组行双侧卵巢摘除术，术后8周制作股骨干骨折模型，骨折后8周处死大鼠。采用ELISA法检测血Ⅰ型前胶原氨基端前肽（PINP），X线摄片及评分观察骨折愈合情况，骨密度检测骨折侧股骨骨密度，生物力学分析骨折侧股骨最大载荷。结果（1）血清PINP水平：A组显著低于其余各组，C、E组显著高于B组，D组显著低于C组。（2）X线示A、E组愈合良好，B组多数标本可见模糊骨折线，C、D组略好于B组。评分结果：A、E组显著高于B、C、D组。（3）骨密度：股骨全长及中段骨密度A组最高，E、D、C组次之，B组最小。（4）最大载荷：A组大鼠骨折侧股骨最大载荷显著高于其余4组，E组显著高于B组。结论骨质疏松大鼠骨量下降、骨折愈合进程延迟，洛伐他汀联合降钙素较单独应用可更有效地抑制骨质疏松大鼠骨量的丢失并促进骨折的愈合。

骨质疏松；骨折；洛伐他汀；降钙素；骨密度；疾病模型,动物

随着人口老龄化的逐步加剧，骨质疏松及骨质疏松性骨折已成为威胁中老年人群健康的主要社会公共健康问题之一。目前临床广泛应用的包括降钙素在内的骨质疏松治疗药物多为骨吸收抑制剂，对骨折愈合的作用尚存争议[1]。1999年Mundy等[2]首次发现洛伐他汀具有成骨作用潜能，此后诸多学者对此进行了深入研究，并进一步证实了洛伐他汀的成骨作用[3-4]，但对骨质疏松性骨折的治疗效果鲜见报道，且有研究显示他汀类药物单独系统性给药的成骨作用有限[5]。本研究拟通过建立骨质疏松性骨折模型，同时给予洛伐他汀和降钙素单独或联合应用，综合分析洛伐他汀联合降钙素应用对骨质疏松性骨折大鼠骨代谢、骨折愈合的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4月龄雌性SD大鼠40只，清洁级，体质量（270±25）g，购自北京维通利华实验动物养殖中心[动物合格证号SCXK（京）2009-0004号]。

1.2 主要试剂和仪器 洛伐他汀（Lovastatin，商品名：美降之，浙江瑞邦药业有限公司），鲑鱼降钙素（商品名：密盖息，瑞士诺华公司），ELISA试剂盒（上海史瑞可生物科技有限公司），Norland-XR 36双能X线骨密度测量仪（美国DEXA公司），X线摄像仪（美国通用公司）。

1.3 动物分组及处理 所有大鼠采用随机数字表法随机分为5组：正常骨折（A）组、骨质疏松性骨折（B）组、洛伐他汀治疗（C）组、降钙素治疗（D）组和洛伐他汀与降钙素联合治疗（E）组，每组8只。A组行假手术。B、C、D、E组行双侧卵巢摘除术：采用1%戊巴比妥钠以40 mg/kg腹腔注射麻醉，背侧入路，以后方髂骨嵴上2 cm、脊柱旁1 cm处取纵行切口，长约1 cm，暴露腹腔卵巢并予以切除后，以丝线将残端结扎，逐层关闭伤口。术后8周所有大鼠制作股骨干骨折模型。A组不予干预；B组按2 mL/kg给予生理盐水灌胃；C组给予洛伐他汀20 mg/kg溶于生理盐水（40 g/L）中灌胃；D组给予降钙素10 IU/kg，皮下注射；E组给予洛伐他汀和降钙素（按C、D组剂量）联合干预，均每天1次。骨折后8周处死大鼠。

1.4 检测指标

1.4.1 血Ⅰ型前胶原氨基端前肽（PINP）水平的测定 所有大鼠处死前留取24 h尿液，再分别抽取外周血2 mL，采用ELISA法检测血PINP值。

1.4.2 计算机X线摄像仪（CR）摄片 将大鼠完整的右侧股骨干骨折标本经CR摄片（距离90 cm，电压40 kV、电流3.2 mA），观察大鼠股骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况[2]。CR摄片评分标准：0分，骨折线清晰可见，无明显骨膜反应；1分，骨折断端边缘趋向模糊，骨膜轻度反应，无骨痂可见；2分，断端边缘模糊，骨膜反应浅淡，骨痂少量，密度较淡，边缘不整齐；3分，断端边缘仍可见，但接近消失，骨膜反应较深，骨痂量增多，但尚未填满缺损，密度增深，边缘较清；4分，断端边缘完全消失，骨膜反应密度近似骨影，骨痂填满缺损，与骨皮质密度相同并相互连接。每张片均由3名骨科医生分别评分，取平均值。如评分医师认为愈合情况介于两种分级之间，可以0.1分为打分单位。

1.4.3 骨密度的测量 应用Norland-XR36 DEXA，采用小物体扫描模式，准确度0.01%，扫描速度60 mm/s，分辨率1.0 mm×1.0 mm，扫描宽度5.0 cm，进行右侧股骨骨密度的测量。测量时，将固定骨折部位的克氏针拔除，依据骨密度测量仪实际扫描测量的股骨长度，分别测量整体骨密度（tBMD）和中段（中1/2）骨密度（mBMD）。

1.4.4 三点弯曲实验 取所有大鼠的右侧股骨行三点弯曲实验，支点跨距（L）为20 mm，中央垂直（股骨与载荷成90°角）施加载荷，速率10 mm/min，在软件里直接得到最大载荷（FM）。

1.5 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件进行处理，数据采用均数±标准差（±s）表示，利用单因素方差分析比较各组均数间的差异，组间多重比较采用LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA检测结果 B、C、D、E组血清PINP高于A组，C、E组显著高于B组，D组低于C组，E组高于D组，其余组间PINP差异无统计学意义，见表1。

Table 1 The results of PINP,BMD,FM and X-ray score in five groups表1 各组大鼠PINP、BMD、FM及X线评分结果（n=8±s）

Table 1 The results of PINP,BMD,FM and X-ray score in five groups表1 各组大鼠PINP、BMD、FM及X线评分结果（n=8±s）

＊＊P＜0.01；a与A组比较，b与B组比较，c与C组比较，d与D组比较，P＜0.05

组别A组B组C组D组E组F PINP（mg/L）0.142±0.039 0.286±0.057a0.304±0.043ab0.281±0.040ac0.325±0.045abcd1 486.462＊＊tBMD（g/cm2）0.218±0.015 0.161±0.017a0.175±0.012ab0.181±0.011abc0.190±0.016abcd1 314.078＊＊组别A组B组C组D组E组F mBMD（g/cm2）0.206±0.014 0.150±0.012a0.171±0.010ab0.174±0.020abc0.183±0.015acbd1 177.430＊＊FM（N）78.62±12.37 38.60±9.46a49.10±16.71a49.60±12.58a57.50±13.92ab7.654＊＊X线评分4.95±0.67 2.63±0.39a3.19±0.36a3.13±0.35a4.08±0.45abcd19.612＊＊

2.2 骨密度检测结果 不同组间股骨tBMD及mBMD差异均有统计学意义，表现为A组最高，E、D、C组次之，B组最低，见表1。

2.3 生物力学检测结果 A组大鼠骨折侧股骨FM高于其余4组，E组高于B组，其余组间FM差别无统计学意义，见表1。

2.4 X线检查结果 A组大鼠骨折愈合较好，多数标本骨折线消失；B组愈合显著延迟，骨折线仍可见，骨痂密度较淡，仍明显低于正常骨组织；C、D组略好于B组；E组较B组改善明显，个别标本愈合情况良好，断端边缘模糊，甚至接近消失，见图1。X线评分结果显示A、E组高于B、C、D组，且A组高于E组，其余组间差别无统计学意义，见表1。

3 讨论

3.1 骨质疏松对骨折愈合的影响 骨质疏松对骨折愈合的不利影响已屡有报道[6-7]。骨折愈合进程大致分为血肿机化演进期、原始骨痂形成期、骨痂塑形改造期，即一般所说的早、中、晚期。本研究选择6月龄大鼠骨折后8周为观测时间点，正常大鼠大致处于骨痂塑形或更成熟阶段，但影像学分析和生物力学检测结果均提示骨质疏松大鼠骨痂仍未成熟，也再次证实了在去卵巢建立的大鼠骨质疏松骨折模型中，不仅骨密度显著降低，骨折愈合进程较正常大鼠明显延迟。

Figure 1 Results of X-ray film in five groups of model rats图1 各组模型X线检测结果

3.2 联合用药与单独用药效果比较 诸多研究证实部分他汀类药物包括辛伐他汀和洛伐他汀具有成骨作用潜能，尤以体外研究为著[3,8]。体内研究中对他汀类药物的成骨作用尚未达成一致结论，局部用药尤其是复合他汀类药物的生物缓释材料成骨效果显著[9]，但系统性给药到达骨组织的药物浓度过低，成骨效果受限[5]。然而系统给药具有对骨折局部干预少、实施方便易行等优点。联合用药为解决这一问题提供了新的思路[10]，因此本研究采用洛伐他汀与骨吸收抑制剂联合应用，探讨药物在抑制骨吸收的基础上充分发挥其促骨形成的作用。降钙素作为临床治疗骨质疏松的一线药物，其对骨折愈合的不良反应尚鲜见报道，因此本研究选择降钙素作为联合药物。结果证实，虽然单独用药组对骨密度的维持及骨折愈合均有一定的积极作用，但效果不及联合用药明显，洛伐他汀与降钙素联合用药不仅更大限度地维持了骨质疏松大鼠的骨量，还在此基础上促进了骨质疏松大鼠骨折的愈合，改善其力学性能。

3.3 生化指标检测结果及分析 外周血中特异性生化标志物的检测有助于分析药物干预后大鼠骨代谢状态的改变，作为反映骨形成活跃程度的血清骨代谢指标PINP检测结果显示，正常大鼠骨形成状态反而更低，其原因可能为：模拟绝经后骨质疏松大鼠的骨转换水平明显增高，即骨吸收与骨形成活性同时增加，而对于不存在高骨吸收活性的正常大鼠，其正常骨形成能力足以保证骨折的顺利愈合。洛伐他汀单独或联合降钙素应用后PINP的血清学水平均显著高于B组，可能与洛伐他汀刺激骨形成的作用有关，具体原因尚有待进一步研究证实。

[1]McDonald MM,Dulai S,Godfrey C,et al.Bolus or weekly zoledronic acid administration does not delay endochondral fracture repair but weekly dosing enhances delays in hard callus remodeling[J].Bone,2008,43(4):653-662.

[2]Mundy G,Garrett R,Harris S,et al.Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins[J].Science,1999,286(5446):1946-1949.

[3]Li X,Cui Q,Kao C,et al.Lovastatin inhibits adipogenic and stimulates osteogenic differentiation by suppressing PPARgamma2 and increasing Cbfa1/Runx2 expression in bone marrow mesenchymal cell cultures[J].Bone,2003,33(4):652-659.

[4]Gutierrez GE,Edwards JR,Garrett IR,et al.Transdermal lovastatin enhances fracture repair in rats[J].J Bone Miner Res,2008,23(11):1722-1730.

[5]von Stechow D,Fish S,Yahalom D,et al.Does simvastatin stimulate bone formation in vivo[J]?BMC Musculoskelet Disord,2003,4:8.

[6]Chen GQ,Wang S,Hu SY.Osteoporosis increases chondrocyte proliferation without a change in apoptosis during fracture healing in an ovariectomized rat model[J].Mol Med Report,2012,5(1):202-206.

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[9]Yoshii T,Hafeman AE,Esparza JM,et al.Local injection of lovastatin in biodegradable polyurethane scaffolds enhances bone regeneration in a critical-sized segmental defect in rat femora[J].J Tissue Eng Regen Med,2012 Jun 20.doi:10.1002/term.1547.[Epub ahead of print]

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（2013-06-17收稿 2013-10-08修回）

（本文编辑 李鹏）

The Effect of Lovastatin Combined with Calcitonin on Fracture Repair in Osteoporotic Rats

CAO Guolong1,LIU Xiaopo1,FENG Yunbo1,TIAN Faming2
1 Department of Orthopedic Surgery of Tangshan Gongren Hospital,Tangshan 063000,China;2 Medical Research Center of Hebei United University

ObjectiveTo investigate the effects of lovastatin alone or combined with calcitonin on fracture repair in osteoporotic rats.MethodsForty 4-month-old female SD rats were randomized into 5 groups（8 rats in each group）:normal fractured group(A),osteoporotic fractured group(B),lovastatin treatment group(C),calcitonin treatment group(D)and lovastatin combined with calcitonin treatment group.All rats except group A

bilateral ovariectomy.The midshaft femur fracture model was established in all rats 8 weeks after operation.The serum level of procollagen amino-terminal propeptide(PINP)was assessed by ELISA.X-ray and bone mineral density detection was used to observe the fracture healing process.The maximal loading of femoral fractures was analyzed by biomechanical method.Results(1)The serum level of PINP was significantly lower in group A than that of other groups.There was a significantly higher level of PINP in group C and group E than that of group B,and the level of PINP was significantly lower in group D than that of group C.(2)The X-ray showed more progressed fracture healing in group A and group E.The accordingly score indicated that there was a markedly higher score in groups A and group E compared to that of other three groups.(3)There was a highest bone mineral density in the full-length and in the middle of femur bone in group A,followed by group E,group D and group C.The lowest bone mineral density was found in group B.(4)The biomechanical test showed that the maximal loading in femur fracture side was significantly higher in group A than that of other four groups,in which it was higher in group E than that of group B.ConclusionThe osteoporosis decreased bone mass and delayed fracture healing process in rat model.The treatment of lovastatin combined with calcitonin showed more positive effect on preventing bone loss and promoting fracture repair than lovastatin alone.

osteoporosis；fractures,bone；lovastatin；calcitonin；bone density；disease models,animal

R683 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.014

1唐山市工人医院骨外科（邮编063000）；2河北联合大学医学实验研究中心

△通讯作者 E-mail：tfm9911316@163.com