线粒体DNA D-loop基因多态性与肾透明细胞癌关系的研究*

张胜雷 徐金升 白亚玲 张俊霞 崔立文 张慧然

线粒体DNA D-loop基因多态性与肾透明细胞癌关系的研究*

张胜雷 徐金升△白亚玲 张俊霞 崔立文 张慧然

目的探讨线粒体DNA D-loop（mtDNA D-loop）基因多态性与肾透明细胞癌的关系。方法采用聚合酶链反应（PCR）对59例肾透明细胞癌患者（肾癌组）和68例健康对照（对照组）的mtDNA D-loop区进行扩增并测序。将测序结果与线粒体文库中的Revised Cambridge Reference Sequence（rCRS)比对分析。分析2组人群中mtDNA D-loop区多态位点出现频率的差异。结果在对照组和肾癌组中的mtDNA D-loop区共发现143个多态性位点。与对照组比较，肾癌组患者的mtDNA D-loop区的262T、16293G出现的频率明显增高，16298C、16319A出现的频率下降（P＜0.05）。结论mtDNA D-loop区的多态性分析可作为肾透明细胞癌患者发生的预测因子，有助于早期发现肾透明细胞癌患者。

腺癌，透明细胞；癌，肾细胞；多态现象，遗传；序列分析；DNA，线粒体

肾透明细胞癌占肾脏恶性肿瘤的85%～90%，占成人恶性肿瘤的3%[1]。随着研究的深入相继发现许多与肾透明细胞癌相关的肿瘤分子标志物，如碳酸酐酶Ⅸ[2]、EphA2[3]、HIF-1/VHL[4]、VEGF[5]等，但至今尚未发现能够有效诊断肾透明细胞癌的生物学标志物。线粒体DNA(mtDNA)作为核外唯一遗传物质处在活性氧和自由基包围之中，缺乏组蛋白保护和完整的修复系统，与核内基因组相比，mtDNA更易发生突变[6-7]。mtDNA突变和多态性热点区域主要集中在包括D-loop在内的非编码区域[8]，D-loop区的多态性与肝癌[9]、食管癌[10]、肺癌[11]等肿瘤的发生密切相关，但其与肾透明细胞癌发生间的关系尚不清楚。本研究旨在探讨mtDNA D-loop基因多态性与肾透明细胞癌发病的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2002年8月—2007年8月行肾癌根治术的肾透明细胞癌患者59例，作为肾癌组，其中男34例，女25例，平均年龄（52.6±3.7）岁，术前均未经过放疗、化疗，经2名资深病理专家确认病理类型均为肾透明细胞癌。选取同期健康查体者68例作为对照组，其中男43例，女25例，平均年龄（56.9±5.2）岁。2组间性别（χ2=0.416）、年龄（t=0.583）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 DNA提取 清晨空腹取2 mL静脉血，应用全血mtDNA萃取试剂盒迅速提取mtDNA，于-20℃冰箱保存备用。

1.3 引物合成及PCR扩增 参照文献[9]设计扩增mtDNA D-loop区的引物。上游：5′-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3′；下游：5′-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3′。产物大小为982 bp，引物合成和纯化均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。PCR反应采用25 μL反应体系。反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，38个循环，最后于72℃延伸5 min。

1.4 DNA测序及结果分析 将PCR反应产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司利用ABI PRISM 3100 DNA序列分析仪将PCR扩增产物进行测序，由于D-loop区序列较长，同一标本采用双向重复测序。将测序结果拼接后，利用DNAman软件分析肾透明细胞癌患者和健康人的mtDNA D-loop区序列，并与人mtDNA文库记录的剑桥序列（revised cambridge reference sequence,rCRS)进行比对，筛选出mtDNA D-loop区的多态性位点。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件包进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，行t检验。计数资料以例（构成比）表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mtDNA D-loop基因多态性位点的分布情况 2组中的mtDNA D-loop区共发现143个多态性位点，其中有14个多态性位点在2组出现的频率大于5%，分别是262、263、309-310、315-316、488、489、523、525、16293、16298、16304、16319、16362、16519。

2.2 mtDNA D-loop区基因多态性与肾透明细胞癌之间的关系 见表1。与对照组相比，肾癌组患者的mtDNA D-loop区的262T、16293G出现的频率明显增高，16298C、16319A出现的频率下降（P＜0.05或P＜0.01）。

Table 1 Comparison of the polymorphism of mitochondrial DNA D-loop region between two groups表1 2组线粒体DNA D-loop区基因多态性的比较 例（构成比）

3 讨论

mtDNA由16 568个碱基对组成，含有37个基因，其中13个蛋白质基因，2个rRNA基因，22个tRNA基因[12]。人类衰老、糖尿病以及肿瘤等疾病的发生与mtDNA氧化损伤关系密切[13]。近年来研究发现，在肝癌[9]、食管癌[10]、肺癌[11]等多种实体恶性肿瘤中存在mtDNA的高频率突变，提示mtDNA的突变与肿瘤发生密切相关。

mtDNA突变主要集中在包括D-loop在内的非编码区域[9]。D-loop区在mtDNA的转录和复制中起着重要的调控作用，D-loop区的突变可能会导致mtDNA复制和基因表达异常，最终导致肿瘤的发生。基因多态性是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，已成为继限制性片段长度多态性（RFLP）标志和微卫星标志后的第三代标志物，在多基因疾病的易感基因研究领域广泛应用，mtDNA D-loop区多态性位点与多种肿瘤的致癌风险有关[14-15]。本研究结果发现，肾透明细胞癌患者中多态性位点16293G（A突变为G）、262T（C突变为T）的出现频率明显高于对照组，多态位点16293和262分别属于mtDNA D-loop高变区1和高变区2，此序列具有高突变频率，但其具体作用机制尚不清楚[16]，可能是由于线粒体基因组转录发生改变，导致呼吸链电子传递异常，产生大量活性氧自由基，进而促进肿瘤的发生、发展，其中有文献报道16293位点的多态性与肝细胞癌发病风险有关[9]。本研究同时发现mtDNA D-loop区的16298和16319位点突变在肾癌组低于对照组，提示16298和16319位点突变在抑制肿瘤发生过程可能起一定的作用，但其具体作用机制尚不清楚。有文献报道16298位点的多态性在抑制小细胞肺癌中也起着一定的作用[11]。262位点和16319位点的多态性在其他肿瘤发病风险研究中尚鲜见报道。

总之，mtDNA D-loop区的多态性分析可作为肾透明细胞癌患者发病风险的预测因子，有助于早期发现肾透明细胞癌患者。根据肿瘤早发现、早诊断、早治疗的理念，应该建立mtDNA D-loop区多态位点分析平台，推广到其他肿瘤并筛选出易患肿瘤的高危人群，进行适当指导，以降低肿瘤发病风险。

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（2013-07-30收稿 2013-11-15修回）

（本文编辑 魏杰）

Relationship between Polymorphisms of Mitochondrial DNA Displacement-loop and Renal Cell Carcinoma

ZHANG Shenglei,XU Jinsheng,BAI Yaling,ZHANG Junxia,CUI Liwen,ZHANG Huiran
Department of Nephrology,The Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China

ObjectiveTo investigate the relationship between polymorphisms in mitochondrial displacement-loop(mtDNA D-loop)and renal cell carcinoma.MethodsFifty-nine patients with clear cell renal cell cancer(renal cancer group)and 68 healthy control(control group)were selected in this study.The mtDNA D-loop region was amplified and sequenced using polymerase chain reaction(PCR).Data were compared and analysed with the Revised Cambridge Reference Sequence(rCRS)in library of mitochondria.The difference in frequency analyses of mtDNA D-loop region was compared between two groups.ResultsA total of 143 single nucleotide polymorphisms(SNP)of mitochondria D-Loop region were detected in renal cancer group and control group.Compared with control group,there were significantly higher frequencies of 262T and 16293G alleles in mitochondria D-loop region,and significantly lower frequencies of 16298C and 16319A alleles,in renal cancer group(P＜0.05).ConclusionThe analysis of genetic polymorphisms in the D-loop can be used as predictors of renal cell carcinoma and contribute to the early detection in patients of renal cell carcinoma.

adenocarcinoma,clear cell;cancer,renal cell;polymorphism,genetic;sequence analysis;DNA,mitochondria

R737.11,R394.3 【

】 A 【DOI】 10.3969/j.issn.0253-9896.2014.03.003

*河北省科技计划项目（项目编号：122777219）

河北医科大学第四医院肾内科（邮编050011）

△通讯作者 E-mail:xjs5766@126.com