重编程诱导多功能干细胞的研究进展*

郭晓令， 刘 庆， 王 婵， 郭永龙， 余榕捷， 陈建苏,2,△

(暨南大学 1再生医学教育部重点实验室， 2医学院眼科研究所，3附属第一临床学院眼科， 4生命科学技术学院细胞生物学系，广东 广州 510632)

诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，即通过不同的转导方法，将影响重编程的关键转录因子、RNA、蛋白或小分子化合物导入到成体细胞，使其“返老还童”回到胚胎干细胞状态，并能够被诱导分化产生不同的细胞类型。iPSCs的问世，对干细胞的发展具有划时代的意义，使得患者来源的体细胞可以被诱导成iPSCs，用于相关疾病的检测分析与干细胞治疗，规避了免疫排斥和道德论理等问题。但是由于iPSCs诱导的低效性和致瘤性，使得这个“新星”在临床中的应用被质疑，目前科学家一直围绕这2个核心问题展开研究，通过改进转导途径，改变重编程方法来提高它的安全性和效率，并取得了一系列喜人的结果，从而使iPSCs未来用于临床的前景变得越来越光明。

1 可诱导多功能干细胞取材不同的靶细胞

2006年，Takahashi等[1]首次实现将Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4转录因子导入到小鼠皮肤成纤维细胞,获得了类似于胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES)的多能性干细胞, 并命名为“诱导多能性干细胞”，从而拉开了iPSCs研究的序幕。2007年，Takahashi等[2]和Yu等[3]又分别将人成纤维细胞诱导成iPSCs, 从而使iPSCs用于临床治疗的可能性又向前迈进了一步。2008年，Aoi等[4]将4种转录因子导入到鼠内胚层的肝脏细胞和胃上皮细胞，成功重编程出iPSCs。同年，Hanna等[5]又将4种转录因子导入到鼠中胚层的B淋巴细胞，成功诱导出iPSCs。2008年，Kim等[6]实现了将2种转录因子导入到人外胚层的神经干细胞，从而实现了iPSCs的重编程。2011年，Zhou等[7]从人的尿液中提取的肾小管细胞成功重编程出iPSCs，这使得诱导iPSCs取材细胞来源更加丰富和多样化。由于取材细胞来自三胚层的体细胞(表1)，所以从理论上讲，机体的所有细胞均可被诱导成iPSCs。

2 通过不同途径重编程iPSCs

Takahashi等[1]首次实现了iPSCs在DNA水平的重编程，但是重编程效率很低，而且由病毒介导，同时转录因子中包含了c-Myc 致瘤蛋白，安全性较差。近几年，通过不断的改进技术，分别实现了在RNA水平、蛋白质水平以及小分子化合物水平的iPSCs重编程，使重编程iPSCs的安全性和效率得到相应的提高。

表1 总结不同种属的不同细胞重编程

2.1通过DNA途径的重编程iPSCs 鼠和人的体细胞能通过一系列转录因子，在DNA水平实现重编程为iPSCs(表2)。2006年，Takahashi等[1]首次通过Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4因子将鼠的体细胞重编程iPSCs。2007年，Yu等[3]报道另一套转录因子Oct4、Sox2、Nanog及Lin8，将体细胞重编程为iPSCs。2008年，Duinsbergen等[8]和Wernig等[9]又分别实现了利用3种转录因子(Oct4、c-Myc和Klf4；或Oct4、Sox2和Klf4)将体细胞重编程为iPSCs。同年，Kim等[6]也实现利用2种转录因子Oct4、Klf4或c-Myc将神经干细胞重编程为iPSCs， Huangfu等[10]成功利用Oct4和Sox2转录因子重编程成纤维细胞。通过进一步改进实验方法，Kim等[11]仅用一种关键转录因子Oct4实现了对神经干细胞的重编程。

表2 总结重编程不同细胞的不同转录因子

2.2通过RNA途径的重编程iPSCs DNA途径的重编程无法规避基因插入而引起致瘤的风险，为了提高重编程iPSCs的安全性，2010年，Yakubov等[12]首次报道通过RNA途径将人的体细胞重编程为iPSCs。通过在体外使用T7 RNA聚合酶和线性化质粒pTMA，构建合成Oct4、Lin28、Sox2及 Nanog的mRNA系统，合成4种转录因子的mRNA,利用脂质体转染到人的体细胞，从而实现重编程iPSCs。但是由于mRNA的稳定性差，需要每间隔24 h 连续转染mRNA，直到出现iPSCs阳性克隆为止，所以操作起来较麻烦。同年，Warren等[13]通过对体外合成Klf4、c-Myc、Oct4及Sox2 mRNA进行5’端糖基化和甲基化修饰，延长mRNA的半衰期，从而转染1次可以稳定表达较长时间，显著简化重编程过程。2013年, Yashioka等[14]进一步改进技术，构造出能够自我复制的VEE-RF RNA复制子，该复制子会在降解之前能高表达4种重编程因子(Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc或Glis1)RNA，将其导入到人的体细胞，可成功重编程出iPSCs，从而使RNA水平重编程技术得到更大提高。另外，Anokye-Danso等[15]在外加Hdac2，将外源合成的miR302/367克隆到pLOVE载体上，将其转染到人和鼠的成纤维细胞，成功重编程出iPSCs，使RNA水平的重编程更加多样化。

2.3通过蛋白途径的重编程iPSCs Zhou等[16]首次报道通过蛋白途径实现了对小鼠体细胞的重编程，将Oct4、Sox2、Klf4、及 c-Myc 4种转录因子的基因克隆到原核生物表达载体上，并在其末端外加11个精氨酸残基的基因，构建融合蛋白表达载体，使其在大肠杆菌中大量表达，从而纯化获取4种转录因子对应的蛋白。2013年，Nemes等[17]再次报道利用改造后的4种关键转录蛋白将鼠的体细胞重编程为iPSCs,并将iPSCs注射到小鼠的早期胚囊中，成功获得嵌合体小鼠。不仅通过原核表达载体获取的转录蛋白可以重编程iPSCs,来自真核表达载体的转录蛋白同样能重编程iPSCs。Kim等[18]分别将Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的基因进行改造，在其末端加上具有细胞膜穿梭功能的CPP短肽基因，构建真核表达重组载体，使其在真核细胞内表达，从而获取构象上更接近真核的4种融合转录蛋白，将其加入到诱导培养基，不用外加小分子化合物便可将人的体细胞重编程为iPSCs。随后，Kim团队基于蛋白途径重编程的iPSCs,诱导其定向分化为功能性多巴胺神经元细胞，并移植这些细胞到患有帕金森疾病的小鼠模型中，成功达到了治疗的效果[19]。由于没有外源基因的介入，安全性高，从而为未来人类个性化的细胞治疗帕金森疾病开辟了全新的道路。2012年，Zhang等[20]对带有11个精氨酸的融合蛋白介导的重编程与带有穿膜肽融合蛋白介导的重编程效率进行了比较，发现带有穿膜肽的4种转录蛋白重编程的效率要明显高于带有11个精氨酸的转录蛋白。

2.4通过小分子化合物途径的重编程iPSCs 重编程的发生主要与核小体中DNA的甲基化和组蛋白的酰基化以及一些关键信号通路有关，通过影响细胞的表观遗传学及关键信号通路，可以获得重编程效果。2011年，Li等[21]通过寻找影响重编程的表观遗传和关键信号通路的抑制剂或激活剂，首次报道仅用Oct4一种转录因子，外加VC6T(VPA、CHIR 99021、616452和tranylcypromine)4种小分子化合物成功将鼠的体细胞重编程为iPSCs，从而实现了利用小分子化合物取代Sox2、Klf4 及c-Myc 3种关键转录因子。2013年，通过改进技术，我国的Hou等[22]成功利用6种小分子化合物VC6TF(VPA、CHIR99021、616452、Tranylcypromine、FSK和DZNep)彻底取代了4种关键转录因子，实现了在小分子化合物水平的重编程，将鼠的体细胞重编程为iPSCs，其中DZNep在启动内源性Oct4的表达中发挥至关重要的作用。

3 重编程iPSCs的转导方法

3.1病毒转导 Takahashi等[1]首次通过反转录病毒将4种关键的转录因子导入到鼠的体细胞，成功实现了iPSCs在DNA水平的重编程。2008年，Stadtfeld等[23]采用腺病毒包装4种转录因子，将其高效导入到鼠的体细胞，实现iPSCs的成功构建。同年，Hanna等[5]通过慢病毒包装，将4种转录因子导入到鼠的B淋巴细胞，成功诱导出iPSCs。次年，Fusaki等[24]首次报道采用Sendai病毒成功实现了对人的体细胞重编程，Sendai病毒为RNA病毒，介导的重编程不会引起宿主基因插入，从而提高了iPSCs构建的安全性。

3.2脂质体转导 2012年，Park等[25]采用脂质体转染技术，将包含4种转录因子的2种重组载体pCX-OKS-2A及pCX-c- Myc共转染导入鼠的胚胎成纤维细胞，实现非病毒转导的重编程，极大提高了构建iPSCs的安全性，但是转导效率要明显低于病毒转导。

3.3核酸转导 2009年，Gonzalez等[26]首次报道采用核酸转导技术，将融合4种转录因子基因的pCAG-OSKM重组载体导入鼠的胚胎成纤维细胞，成功将其重编程为iPSCs。2010年，Jia等[27]同样采用核酸转导技术，将含有4种转录因子的小环导入人的体细胞，构建出安全有效的iPSCs。

3.4纳米高分子材料转导 2011年，Montserrat等[28]首次报道利用纳米高分子多聚β氨基酯，将融合4种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和GFP报告基因的重组载体pCAG-OSKMG导入的成纤维细胞，成功构建出iPSCs。

4 体内重编程诱导iPSCs的研究

以上研究均是在体外进行的体细胞重编程，随着技术的发展，目前可以实现在体内完成定向重编程[29]，这样获得的iPSCs相比体外重编程的iPSCs更加接近胚胎干细胞(ES cells)的状态，并且比ES细胞具有更好的可塑性和原始性。目前还可以直接将供体细胞导入到体内，在机体微环境和外源化合物的共同作用下，直接重编为目的细胞[30-34]。

5 展望

iPSCs的诞生，使干细胞在再生医学方面的应用得到巨大突破，不仅解决了免疫排斥问题，同时也规避了道德论理等问题。随着iPSCs研究的发展，用来诱导iPS细胞的供体细胞变得越来越广泛和多样化。虽然目前构建iPSCs的效率和安全性有了较大的提高，但是距离广谱的临床应用还有很大差距，需要进一步改进技术。在提高安全性方面，可以侧重蛋白质结合小分子化合物的重编程；在提高效率方面，可以改变转录因子的添加顺序[35]，调整转录因子最佳浓度比例[13]，改善转导时间[36]，优化培养条件[37]等。也可以探索影响重编程的关键信号通路，通过siRNA干扰使其在本体基因水平沉默，这样既不会引起外源基因插入，同时干扰效率也较高。相信在不久将来，通过不断的改进重编程技术和方法，iPSCs会被广泛用于干细胞治疗，造福人类。

[参 考 文 献]

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