乙醇激活的鼻咽癌细胞氯电流的分子机制*

林 娜， 左婉红， 赖周毅， 伍嘉宝， 陈美苑， 汪 源， 陈丽新△， 王立伟△

(暨南大学医学院 1生理学系， 2药理学系，广东 广州 510632)

乙醇是酒的主要成分，近年的研究表明，饮酒与多种恶性肿瘤发生发展密切相关[1-3]，鼻咽癌是我国华南地区的高发肿瘤，流行病学显示饮酒和人类鼻咽癌的发生具有相关性[3]，但其确切机制并不明了。氯通道在多种细胞中广泛表达，并且我们前文中报道容积敏感性氯通道在肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡和容积调节等过程中发挥重要的作用[4-8]。目前国内外研究乙醇和离子通道的关系主要为阳离子通道，对阴离子通道的报道较少。本实验通过膜片钳技术观察乙醇对CNE-2Z细胞氯通道的影响。ClC-3蛋白被认为是容积敏感性氯通道重要的候选蛋白之一，利用siRNA干扰技术沉默ClC-3氯通道探讨乙醇诱导氯电流性质的改变，进一步分析其电流的分子本质，更好地了解和阐明乙醇影响肿瘤细胞恶性生物学行为的机制，为鼻咽癌恶性肿瘤的治疗提供新的靶标和生物学干预手段。

材 料 和 方 法

1 细胞培养

低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞培养于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的RPM I-1640 培养基、37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱内，用0.25%胰酶和0.02% EDTA隔天传代。

2 膜片钳实验

2.1电极内液、灌流液、氯通道阻断剂 电极内液(mmol/L)含70 N-methyl-D-glucamine chloride (NMDG-Cl)、1.2 MgCl2、10 HEPES、1 EGTA、140 D-mannitol和2 ATP，调pH值至7.25，实验前加入ATP。等渗液(mmol/L)含70 NaCl、0.5 MgCl2、2 CaCl2、10 HEPES和140 D-mannitol。47%高渗液含280 D-mannitol,其它成分同等渗液。调pH值至7.4,冰点渗透压计检测渗透压分别为300和440 mOsmol/L。氯通道阻断剂5-硝基-2-(3-苯丙胺基)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid, NPPB] (Sigma)用DMSO配成100 mmol/L的储存液，用前用灌流液稀释至100 μmol/L。

2.2全细胞膜片钳记录 胰酶消化细胞贴于22 mm玻片上，1 h后从培养箱中取出，贴于灌流槽内。用EPC-7膜片钳放大器在全细胞电压钳制模式下记录全细胞电流，钳制细胞在0、±40 mV、±80 mV往复循环，每个钳制脉冲波宽200 ms，间隔为4 s。用等渗灌流稳定3～5 min，记录稳定的基础电流，加入不同浓度乙醇，待电流达到稳定的峰值，加入高渗或氯通道阻断剂分析乙醇激活电流的生理学及药理学特性。

2.3高渗及氯通道阻断剂抑制全细胞电流 待激活电流达到高峰稳定3 min加入含相应浓度乙醇的47%高渗溶液或氯通道阻断剂NPPB。抑制率(%)的计算公式为[(CEtOH-CIso)-(Cblock- CIso)]/(CEtOH-CIso)×100%。其中CIso、CEtOH、Cblock分别为±80 mV电压钳制下等渗、乙醇、乙醇加高渗或阻断剂时的电流值。

3 siRNA干扰ClC-3基因的表达

ClC-3 siRNA双链正义链序列5’-CAAUGGAUUUCCUGUCAUATT-3’，反义链序列5’-UAUGACAGGAAAUCCAUUGTA-3’；对照组无序siRNA正义链序列5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反义链序列5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。siRNA标记有5-FAM荧光基团。参考我们以前发表的方法[9]，对细胞进行转染。转染细胞6 h后在荧光显微镜下检测转染效果。48 h后消化细胞并贴片，在荧光显微镜下选取带荧光(siRNA转染成功)的细胞进行全细胞膜片钳实验。灌流乙醇，观察激活氯通道的情况，分析该电流特性的改变。

4 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示,用SPSS 13.0软件处理,采用F检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 不同浓度乙醇激活CNE-2Z细胞氯电流

当CNE-2Z细胞浸浴在等渗灌流液中，细胞电流小而稳定。待稳定3 min后在等渗灌流液中加入不同浓度的乙醇(0.17、1.7、17、85和170 mmol/L)灌流细胞,激活的电流具有浓度依赖性，+80 mV钳制电压下激活的电流密度呈倒U型，17 mmol/L乙醇激活的电流密度达到峰值，见图1。

Figure 1. The chloride current activated by ethanol with different concentration at ±80 mV in CNE-2Z cells.Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs control group.

2 乙醇诱导CNE-2Z细胞氯电流的容积敏感性

如图2所示，在+80 mV和-80 mV电压钳制下背景电流稳定而微弱，待电流稳定3 min后细胞外灌流17 mmol/L乙醇后，内外向电流均明显增大呈较明显的外向优势，在±80 mV无明显的电压依赖性失活，翻转电位是(-4.4±3.7)mV,接近氯离子的平衡电位-0.9 mV。稳定后，胞外灌流47%高渗溶液，内外向电流均受到明显抑制(P<0.01)，高渗液对内外向电流的抑制率间没有显著差异(P>0.05)。

Figure 2. The ethanol-induced chloride current and inhibition of the current by hypertonicity in CNE-2Z cells. A: the typical course of current recordings; B: the inhibition ratio of the current by hypertonicity at ±80 mV.Mean±SD.n=9.

当乙醇(17 mmol/L)激活的电流达高峰并平稳后，用相同浓度的葡萄糖酸钠替代灌流液中的氯化钠(70 mmol/L)，即用葡萄糖酸根离子置换氯离子。结果显示，乙醇激活的电流明显减弱，+80mV时的电流密度减少了75.5%±1.5% (P<0.01)，翻转电位由(-4.4±3.7)mV变为(18.2±1.9)mV。

3 氯通道阻断剂抑制乙醇诱导的CNE-2Z细胞氯电流

利用氯通道阻断剂NPPB观察该电流的药理学特性。待乙醇激活的氯电流达到高峰稳定3 min后加入100 μmol/L NPPB可见内外向电流均被明显抑制(P<0.01)。

Figure 3. The ethanol-induced chloride current and inhibition of the current by the chloride channel blocker NPPB in CNE-2Z cells. A： the typical course of current recordings; B: the inhibition of the ethanol-induced chloride currents by NPPB at ±80 mV.Mean±SD.n=5.

4 沉默ClC-3氯通道的表达对乙醇诱导电流的影响

4.1荧光显微镜检测转染效果 利用siRNA技术干扰ClC-3氯通道基因的表达，转染细胞6 h后在荧光显微镜下观察转染效果，图4所示ClC-3 siRNA已被成功转染到CNE-2Z细胞。图4A是明场拍摄条件下的细胞形态，图4B是转染ClC-3 siRNA的荧光图像，图4C是不加ClC-3 siRNA的对照组荧光图像(其明场拍摄条件下的细胞形态未显示)。结果显示，转染组的大部分细胞可检测到荧光，而对照组则无荧光。

Figure 4. Inhibition of ethanol-induced chloride currents by ClC-3 siRNA. A～C: transfection efficiency of ClC-3 siRNA detected by the fluorescence microscope; D: I-V relationships. Mean±SD.n=14.**P<0.01 vs ethanol (control) group.

4.2膜片钳记录转染ClC-3 siRNA后乙醇激活的氯电流 成功转染细胞48 h后进行膜片钳实验，按照上述方法，用膜片钳记录等渗液中CNE-2Z细胞的氯电流。背景氯电流稳定而微弱， 待其稳定3 min灌流17 mmol/L乙醇，达到峰值稳定3 min，灌流高渗或氯通道阻断剂。记录细胞的I-V曲线。与未经ClC-3 siRNA处理的CNE-2Z细胞相比，乙醇激活的氯电流密度明显减小，见图4D(P<0.01)。

讨 论

目前认为乙醇与多种恶性肿瘤的发生关系密切，以消化系统肿瘤如口、咽喉、食管、肝、胃、结直肠等部位的肿瘤和乳腺癌、肺癌、前列腺癌多见[2]。鼻咽癌是我国华南地区的高发恶性肿瘤，由于鼻咽解剖位置较深,结构复杂, 并且以非角化型未分化癌为主,极易发生颈部淋巴结和远处转移，严重影响病人生存。近年来流行病学调查及动物学实验结果表明，酗酒与鼻咽癌呈正性相关[3]，因此探讨其本质显得尤为重要。

本研究表明，乙醇可以激活一个较大的电流，此电流的翻转电位接近氯离子平衡电位，用葡萄糖酸根离子替代溶液中的氯离子可以抑制该电流，并使翻转电位远离氯离子的平衡电位，表明此电流主要是由氯离子介导，即一定剂量的乙醇可以激活鼻咽癌细胞的氯通道，并且结果还提示，乙醇敏感的氯通道对葡萄糖酸根离子也有一定的通透性。人血液中乙醇浓度达17 mmol/L是临床上表现为急性乙醇中毒的临界值，本实验中此浓度的乙醇在低分化鼻咽癌细胞上激活一氯电流，并能够被氯通道阻断剂NPPB所阻断，同时能被高渗溶液所抑制，具有容积敏感性。并且我们前文中报道容积敏感性氯通道在细胞的增殖、迁移、凋亡等过程中发挥重要的作用[4-8]，但其确切的分子本质并不清楚。本实验还发现，乙醇浓度过高时，其激活氯电流的效应明显下降甚至消失，其机制不清楚，我们以前的实验发现，ATP对氯通道也有类似的双相作用。

ClC-3是氯通道的一个亚型，被认为是容积敏感性氯通道最重要的候选蛋白之一，在细胞的电活动、容积调控、细胞增殖、分化、迁移、凋亡和胞内酸碱调节中都起着重要作用[8-10]。我们前期实验证明ClC-3氯通道基因在CNE-2Z细胞上呈现高表达状态[4]，为了进一步探讨乙醇激活此种氯电流的分子本质，我们采用siRNA技术干扰ClC-3氯通道蛋白的表达，转染序列由本课题前期实验证明为有效序列[9],利用膜片钳记录相同浓度乙醇激活的氯电流，在CNE-2Z细胞激活的内外向氯电流都明显减小,提示ClC-3氯通道可能是乙醇激活氯电流的主要分子基础。将ClC-3干扰之后，17 mmol/L乙醇仍能够记录到一较微弱的氯电流，提示由于肿瘤细胞结构和功能的复杂性，可能还有其它的通道蛋白介导这种电流的产生，其具体机制还有待进一步探讨。

本研究表明，一定剂量乙醇可以激活氯通道，诱发一个容积敏感的氯电流，而ClC-3氯通道蛋白是乙醇诱导氯电流的分子基础。我们以前的实验表明，氯通道参与细胞迁移和细胞周期的调控，并与鼻咽癌细胞的高增殖特性有关，提示乙醇可以通过激活氯通道促进鼻咽癌的发生发展。

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