骨保护素基因单核苷酸多态性与类风湿关节炎发病的相关性研究*

蔡月明， 龙 霞， 王庆文， 王 菁， 吴志成， 王伟光， 曾慧萍， 张 璐

(北京大学深圳医院 1风湿免疫科, 2中心实验室, 3安徽医科大学北京大学深圳医院临床学院, 4检验科，广东 深圳 518036)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性全身性自身免疫性疾病，以关节持续的滑膜炎、明显的炎症细胞浸润、关节液致炎症因子剧增和侵袭性新生血管翳形成为特点，晚期往往会引起严重的关节畸形和活动障碍，甚至残疾，给病人生活、工作造成极大痛苦，同时给病人家庭和社会带来巨大的负担[1-2]。RA确切病因尚未完全阐明。但RA常在早期即可出现患病关节骨质疏松以及骨与软骨的骨质破坏，目前已经明确破骨细胞是导致RA发病过程中多关节进行性软骨和骨质侵蚀破坏、骨矿物质溶解丢失的重要参与者。大量研究[ 3-4 ]证实，骨保护素(osteoprotegerin, OPG)/核因子κB受体激活因子(receptor activator of NF-κB, RANK)/核因子κB受体激活因子配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)系统是调节破骨细胞分化、成熟和凋亡最重要的信号通路。近年来，一些研究发现，OPG/RANK/RANKL系统单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)与骨代谢更新、骨侵蚀及骨矿物质溶解丢失相关，并在骨质疏松[5]、骨髓瘤[6]、心血管疾病[7]、肿瘤[8]、缺血性脑卒中[9]中做了研究探索，但与RA的关联性研究较少。本研究拟通过比较OPG的基因多态性163A/G(rs3102735)及245T/G(rs3134069)在中国汉族RA人群与健康对照人群的不同分布，对OPG的基因多态性与RA发病的关系进行探讨。

材 料 和 方 法

1 研究对象

376例研究对象血样取自2010年8月至2011年9月门诊及住院的RA病人及同期进行健康体检的人群。其中健康对照组171人，RA组205人。健康对照组男74人(43.3%)，女97人(56.7%)，年龄22～81岁，平均(41.6±11.2)岁。 RA组男30人(14.6%)，女175人(85.4%)，年龄14～81岁，平均(48.5±14.5)岁。研究个体均为中国汉族人，无血缘关系。

RA诊断符合美国风湿病学会1987年RA分类标准。记录患者的临床资料，包括症状、体征、实验室检查及治疗情况。患者定期随诊，每2周～1个月监测1次血常规、肝肾功能变化。观察半年内病情变化情况。

2 主要试剂

PCR扩增仪(Eppendorf Mastercycler Gradient)；低温高速离心机(Thremo Scientific Heraeus Multifuge)；恒温加热器(TU-10，上海沪粤明科学仪器有限公司 )；电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；水平电泳系统和凝胶成像系统(Bior-Rad)；DNA序列合成(南京金斯瑞)；基因组DNA提取试剂盒(Blood Genome DNA Extraction Kit)和PCR扩增试剂盒(Premix Taq Version 2.0)购自大连宝生物公司；DNA Marker(Tiangen)；AseI和HinfI内切酶购自NEB。

3 主要方法

3.1DNA模板的制备 取研究对象外周静脉血2 mL，枸橼酸钠抗凝，用Blood Genome DNA Extraction Kit提取DNA，按说明书进行操作。

3.2扩增引物设计 以Primer 5软件并参考文献[10]设计扩增模板的引物，设计后经过BLAST比对分析。上游引物5’-CTGGAGACATATAACTTGAACA-3’，下游引物5’-CCATCATCAAAGGGCTATTGGT-3’，产物长度为300 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

3.3PCR反应体系与条件 用Eppendorf Mastercycler gradient PCR扩增仪，采用TaKaRa的Premix Taq Version 2.0反应试剂盒进行PCR扩增：反应总体积30 μL，含1 μg基因组DNA，Premix Taq(dNTP 20 μmol/L，耐高温TaqDNA聚合酶0.75 U，MgCl21.5 mmol/L)15 μL,上、下游引物各2.0 μL(5 pmol/μL)，ddH2O 8 μL，总体积30 μL。扩增条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，扩增40个循环，最后72 ℃终末延伸10 min。PCR反应完成后，取5 μL产物，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，80 V电压，50 min，凝胶成像仪下观察结果并照相保存图像。

3.4限制性核酸内切酶酶切检测基因型 取PCR扩增产物分2管，每管各10 μL，分别加入相应缓冲液2 μL，ddH2O 7 μL，其中一管加入OPG 163A/G位点的限制性核酸内切酶AseI 5 U，另一管加245T/G位点的限制性核酸内切酶HinfI 5 U，每管总体积为20 μL，在37 ℃恒温下水浴消化5～15 min，加入6×loading buffer 4 μL终止酶切反应。取酶切产物用2%琼脂糖凝胶(含0.5 g/L溴化乙啶)，70 V电压电泳60 min，凝胶成像仪下观察结果并照相保存图像。

4 统计学处理

结 果

1 RA组临床特征

研究纳入RA患者205人，男30人(14.6%)，女175人(85.4%)，年龄14～81岁，平均(48.5±14.5)岁，病程平均(15.4±10.2)月，超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)平均(11.5±22.6) mg/L，类风湿因子(rheumatoid factor,RF)平均(40.6±20.3) IU/L，血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)平均(41.5±19.8) mm/h，肿胀关节数平均(3.67±4.52)个，疼痛关节数平均(12.08±8.52)个。

2 OPG基因 163A/G及 245T/G 位点PCR扩增结果及酶切结果

以外周血基因组DNA为模板，用合成的引物进行OPG基因PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示扩增的PCR产物为300 bp，OPG163A/G位点在内切酶AseI 的作用下分解为161 bp 和139 bp 2个片段，AA为纯合子显示2条带(161 bp和139 bp)，GG为纯合子仅1条带(300 bp)，AG为杂合子显示3条带(300 bp、161 bp和139 bp)；245T/G位点在内切酶HinfI 的作用下分解为245 bp 和55 bp 2个片段，GG为纯合子(245 bp和55 bp)，TT为纯合子(300 bp)，TG为杂合子(300 bp、245 bp和55 bp)。电泳图中55 bp不显影，见图1、2。

Figure 1. PCR amplication result of 163A/G locus in OPG gene and the result of Ase I enzyme digestion.Lane 1: 163GG; Lane 2: 163AG; Lane 3: 163AA.

Figure 2. PCR amplication result of 245T/G locus in OPG gene and the result of Hinf I enzyme digestion.Lane 1: 245TT; Lane 2: 245TG; Lane 3: 245GG.

3 基因型和等位基因的分布

RA组OPG基因163A/G基因型频率分别是AA 62.0%、AG 30.7%和GG 7.3%，野生型等位基因A 77.3%，突变型等位基因G 22.7%，对照组分别是AA 69.6%、AG 28.7%和GG 1.8%,等位基因分别为A 83.9%和G 16.1%，2组比较差异有统计学意义(2=6.993，P<0.05)。比较2组人群各基因型的分布，结果显示GG基因型在2组有显著差异(2=6.329，P<0.05)，AA基因型及AG基因型均未见显著差异(分别为2=2.405及2=0.192，P>0.05)。245T/G在2组的比较差异无统计学意义(P>0.05)，分别为RA组TT 86.3%、TG 13.2%和GG 0.5%，对照组TT 84.2%、TG 14.6%和GG 1.2%。等位基因的比较亦未见显著差异(P>0.05)，分别为RA组T 93.0%和G 7.0%,对照组T 91.5%和G 8.5%。这表明OPG基因163A/G单核苷酸多态性与我国汉族人群RA发病可能相关联，但245T/G与发病无明显相关性,见表1、2。

4 OPG 163A/G及 245T/G基因连锁不平衡分析

根据连锁不平衡分析，rs3102735和rs3134069存在不完全连锁，LOD=1，R2=0.14。

5 163A/G及245T/G多态性与疾病的关联性分析

建立多因素Logistic回归模型，调整年龄、性别、病程、RF、ESR、hs-CRP和肿痛关节数后，OPG163G等位基因患RA的OR为1.219(95% CI：1.066～2.339，P<0.05),表明携带OPG163G基因型者患病危险性是非携带者的1.219倍。245T/G未被纳入回归方程,表明与RA无明确关系。

表1 OPG 163A/G基因型在RA组和对照组中的分布

表2 OPG 245T/G基因型在RA组和对照组中的分布

讨 论

RA发病机制纷繁复杂，涉及基因与环境多种因素，确切机制目前仍不完全清楚。针对RA发病机制中骨质疏松以及骨与软骨破坏的研究发现提示可能与OPG/RANK/RANKL系统相关。而正常骨重建过程包括成骨细胞骨形成与破骨细胞骨吸收，两者维持体内骨代谢的动态平衡。OPG/RANKL系统调节破骨细胞的分化、成熟及病理状态下的骨质流失。在炎症因子刺激下，RA关节周围组织能表达RANKL，且能提供破骨细胞前体细胞。RANKL与表达于破骨细胞前体细胞胞膜上的受体RANK结合，通过调控破骨细胞分化、成熟并抑制其凋亡，对RA骨质溶解、软骨破坏等过程发挥极为重要的调控作用，而OPG通过拮抗RANKL发挥作用[11]。

OPG是肿瘤坏死因子受体家族成员，人类OPG基因位于染色体8q23～24，OPG蛋白由401个氨基酸残基组成，常以同二聚体形式分泌到胞外。OPG在人体的骨组织中有较高表达，主要由成骨细胞及骨髓基质细胞分泌。在骨组织中，OPG作为一种诱饵受体，能与RANKL或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)竞争性结合，以阻断RANKL与RANK结合，发挥抑制破骨细胞分化、成熟，诱导破骨细胞凋亡的作用[12]。针对OPG/RANK/RANKL系统在RA发病过程的候选基因关联分析和全基因组SNPs扫描，被用来研究RA的遗传学成因，发现了一些与RA相关的基因位点。这就更进一步证实OPG/RANK/RANKL系统与RA关系密切。

本研究选取的163A/G和245T/G位于OPG基因启动子区。通过病例-对照研究遗传流行病学的关联分析结果显示，OPG163A/G基因型频率和等位基因频率2组比较差异有统计学意义，但245T/G在2组之间的差异无统计学意义，表明OPG基因163A/G单核苷酸多态性与我国汉族人群RA发病相关，但245T/G与发病无明显相关性。建立多因素回归模型，调整其它调查因素年龄、性别、病程、RF、ESR、hs-CRP、肿痛关节数后，OPG163GG型患RA的OR为1.219，进一步证明163A/G单核苷酸多态性与我国汉族人群RA发病相关。目前国内尚无OPG多态性与RA相关性的研究报道。

Hussien等[13]在埃及人群中的调查认为，OPG163A/G与RA易感性相关，并且与RA患者的骨质疏松相关，是RA患者中骨质疏松的重要参与因素。 相反的，Assmann等[14]在RA患者与健康对照者所做的病例对照研究中，对RANK、RANKL和OPG的7 个SNPs包括RANKrs1805034、rs35211496、OPGrs3102735、rs2073618以及RANKLrs9533156、rs2277438、rs1054016 进行了分析，并未发现OPGrs3102735、rs2073618与RA相关。Furuya等[15]研究了RA患者OPG的2个SNPs rs2073617和rs2073618位点，未发现在日本人群中与RA的发病及影像学进展有关联。但Masi等[16]对症状出现1年以内、影像学表现2年以内的早期RA的研究表明，虽未发现RA与OPGRsaI限制性酶切多态性的相关性，但认为此SNP与手影像学骨侵蚀相关。2013年，Guo等[17]对OPG相关文章做了荟萃分析，表明 A163G多态性与白种人骨质疏松风险相关，而G1181C多态性的C等位基因则可降低骨质疏松风险，尤其在亚洲绝经后女性中更加明显。

多项研究已经表明OPG基因与骨密度相关。而针对OPGSNPs是否影响骨代谢更新和骨矿物质密度，Choi等[ 18 ]的研究发现，OPGSNPs 163A/G与1181G/C与韩国女性绝经后骨矿物质密度降低有一定相关性，尤其是当同时存在RANK575TT基因型时。Yu等[19]检测了OPG基因18861A>G及25548C>T这2个SNPs，认为18861A>G基因型与中国绝经后妇女脊柱、股骨颈及全髋骨矿物质密度降低相关，与骨质疏松具有关联性。Kim等[ 20 ]研究认为OPGG1181C SNP单独或与RANKLrs2277438 SNP同时存在可作为判断韩国妇女腰椎骨矿物质密度的重要相关遗传因子。

由于目前国内对于OPG/RANK/RANKL系统 SNP与RA的研究尚不多见。本文对OPG基因与RA的关系进行了初步探讨。但由于研究人群数量有限，故进一步的验证尚需多中心和大样本的研究。

[参 考 文 献]

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