COPD患者early-EPCs β2-肾上腺素受体的表达及其对细胞迁移的影响*

刘笑然， 黄鑫炎， 林耿鹏， 谭卫平， 刘扬丽， 谢灿茂△

(1海南医学院附属医院急诊科， 海南 海口 570102; 2中山大学第一附属医院呼吸内科， 广东 广州 510080)

β-肾上腺素受体(β-adrenergic receptor， βAR)是一种7次穿膜的受体。βAR家族包括β1AR、β2AR和β3AR 3个亚型[1]，其经典途经是通过G蛋白增加细胞内的cAMP水平，激活蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)，使下游各靶位点(如NF-κB)磷酸化，调控细胞各项生理活动。小鼠体内淋巴组织中的T细胞和B细胞均有β2AR表达，参与调节细胞的增殖、分化、迁移等功能。用6-羟多巴胺封闭DBA/2小鼠T细胞的β2AR，细胞增殖速度明显增加[2]。 也有学者发现βAR调节细胞迁移，肾上腺素可增加循环中淋巴细胞的数量，给予βAR阻滞剂后淋巴细胞的数量下降[3-4]。体内注入异丙肾上腺素或肾上腺素，能增加小鼠脾脏中淋巴细胞外流的数量[5]。将小鼠淋巴细胞用荧光标记，并用异丙肾上腺素预处理15 min后注入小鼠体内，标记的淋巴细胞较多地分布在脾脏或外周淋巴结中[6]。另有资料显示： CD34+干细胞能表达β2AR[7]，其激动剂调节细胞迁移[8]。交感神经通过β2AR途径促进细胞迁移，β2AR激动剂加速细胞迁移，但慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)患者外周血中的早期内皮祖细胞(early endothelial progenitor cells, early-EPCs)是否表达β2AR及其对细胞迁移的影响如何，目前尚无报道。

材 料 和 方 法

1 病例的来源和选择

从来自25例已戒烟的COPD患者及16例年龄、性别无差异的志愿者外周血中分离CD34+细胞。所有实验均得到海南医学院伦理委员会的同意。

患者入组标准：(1)中、重度COPD(GOLD stages 2～4)；(2)稳定期(研究前4周内肺功能无变化或无恶化)；(3)休息时PO2>60 mmHg；(4)年龄<70岁；(5)近2周内无全身性应用激素治疗。 排除标准：(1)有原发性心血管病，如原发性高血压、脑血管疾病、心律失常等；(2)影响外周血液干细胞数量的疾病，如肿瘤性疾病、肾脏疾病、风湿性疾病；(3)糖尿病及其它代谢性疾病。对照组入选标准：(1)年龄<70岁；(2)肺功能正常；(3)没有临床症状；(4)无吸烟史。

2 实验细胞的制备和鉴定

2.1CD34+细胞的分离提纯 将20 mL静脉血按1∶1用Hanks液稀释，用1.077的Ficoll梯度分离液分离血中的单个核细胞；将5×107个细胞悬浮于100 μL 试剂中，按100 μL抗体1 mL细胞悬液的比例，加入EasySep®抗体混合物(例如，在2 mL细胞悬液中加入200 μL 抗体混合液)，用移液器上下吹打充分混匀，室温孵育15 min。

用移液器上下吹打EasySep®纳米磁珠5 次以上，以确保磁珠均匀一致(不使用涡旋震荡器)；按50 μL 磁珠1 mL 细胞悬液的比例，加入磁珠，充分吹打混匀，室温孵育10 min； 用EasySep®缓冲液将细胞悬液的体积调整至2.50 mL(<5×108cells)，用移液器上下轻轻吹打2～3次，混匀细胞。将试管插入磁极中，静置5 min。将磁铁及试管一起拿起，以连续缓慢的动作倾倒磁极至倒置状态，倒出上清部分。保持磁极及试管倒置2～3 s，然后使试管口恢复向上的位置。从磁极中取出试管，加入2.50 mL(<5×108cells)EasySep®缓冲液。用移液器轻轻吹打细胞悬液2～3次，混匀细胞。将试管放回磁铁中，静置5 min。重复上述步骤，在磁极中的分选过程共4次，每次5 min。从磁极中取出试管，加入适量试剂重悬细胞，得到所需的CD34+细胞并用流式细胞术分析。

2.2检测内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs) 将CD34+细胞种植在有内皮细胞基础培养基2(endothelial basal medium-2,EBM-2)的6孔板中，48 h后，去除不贴壁的细胞，将贴壁细胞用胰酶消化，加入2% BSA孵育30 min，之后加入mAb-CD34-FITC、mAb-CD133-PE及Ⅰ抗mouse anti-human VEGFR2，孵育40 min，再加入Ⅱ抗rabbit anti-mouse APC，20 min后用流式细胞术检测。获得80%表达的EPCs用于本实验研究。CD34+的细胞悬浮液用PBS液加入1% FCS，用2% BSA封闭。

2.3细胞的传代 EPCs为贴壁生长细胞。把经密度梯度离心、磁珠正分选的CD34+细胞均匀种植在3%明胶包被的6孔培养板中，至细胞单层铺满培养皿时，即需分殖至新的培养皿中，一般大概需要10 d左右。 吸掉旧培养基，用无菌1×PBS 1 mL轻轻洗涤细胞1次，加入0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化液1 mL(1 mL/直径10 cm培养皿)，37 ℃、5% CO2培养箱中作用1～2 min，轻拍培养皿使细胞脱落。于显微镜下观察，细胞呈现圆粒状。将洗脱下来的细胞转移至有4 mL EBM-2全培养液的15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min。弃除离心后的上清液，再次加入4 mL EBM-2全培养液，充分吹打混匀细胞和培养液。取新的6孔培养板，加入2～3 mL EBM-2全培养液，取细胞液约0.3 mL加入培养板，37 ℃、5% CO2培养箱培养。

2.4细胞标记 取原液(1 g/L)40 μL加入2 mL EBM-2全培养液中；取1×106EPCs加入放有上述培养基的6孔板中，放入5% CO2、37 ℃的培养箱中6 h。取出培养板，吸除培养基，用Hanks液轻轻冲洗3次，每次5 min。用 4%多聚甲醛固定细胞10 min。 固定后用Hanks液冲洗1次 ，将 FITC-UEA-I(10 mg/L)加入上述标本中在5% CO2、 37 ℃下孵育 1 h。荧光显微镜鉴定 FITC-UEA-I 和 DiI-acLDL 双染色阳性细胞为正在分化的 early-EPCs。整个过程避光进行。Early-EPCs主要表达CD34、CD133和VEGFR2，细胞形态呈大头钉状，一般是在培养的第4～7天出现。

3 β2AR在early-EPCs表达的检测

3.1RT-PCR法测定β2AR mRNA的表达 (1) 细胞总RNA的提取：细胞置于1.5 mL Eppendorf 管，加入Trizol 1 mL裂解细胞提取总RNA，经氯仿/异丙醇纯化和75%乙醇沉淀，真空干燥后加DEPC处理水溶解RNA，加入2.5倍体积乙醇，置-80 ℃保存。(2)逆转录反应：取4 μL RNA模板做逆转录反应，MMLV体系，总反应体积20 μL；反应条件：37 ℃ 1 h，然后95 ℃ 3 min。(3) 定性PCR扩增：用Primer Express 2.0 软件设计引物，β2AR上游引物5’-CGC TTC CAT GTC CAG AAC CT-3’，下游引物5’-TCT TGA GGG CTT TGT GCT CC-3’，扩增片段长度为 106 bp；内参照基因β-actin上游引物5’-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3’，下游引物5’-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3’， 扩增片段长度为106 bp。PCR反应条件为：93 ℃ 5 min；然后93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共40个循环；72 ℃ 7 min。

3.2Western blotting法检测β2AR蛋白的表达 (1)提取细胞膜蛋白：收集对数生长期的细胞至15 mL离心管，加1 mL RIPA裂解液充分混匀，用超声波细胞破碎仪粉碎裂解细胞(10 s×3次)，12 000×g、4 ℃离心30 min，取上清-80 ℃保存；BCA法测定蛋白质浓度，用细胞裂解液调整使各样本蛋白浓度一致；(2)SDS-PAGE ：按配方灌制分离胶和浓缩胶，在调整好浓度的各样本蛋白中加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，100 ℃加热5 min，立即冰上冷却，4 ℃、15 000×g离心1 min，取上清液，用微量加样器按10 μg待测样品/孔上样， 60 mA 电泳30 min，90 mA 60 min；(3)免疫印迹操作：30 V、4 ℃过夜电转膜， 将PVDF膜室温下封闭1 h，分别将β2AR和β-actin 的PVDF膜装入透明塑料袋中，分别按照 1∶400和1∶2 000用2 mL封闭液稀释鼠抗人β2AR Ⅰ抗及兔抗人β-actin Ⅰ抗，摇床上缓慢摇动，4 ℃过夜； 将PVDF膜分别浸入1∶5 000封闭液稀释的抗鼠和抗兔HRP标记的Ⅱ抗中，置摇床上缓慢摇动，室温下孵育40 min； ECL试剂显影，暗室曝光约20 min，冲洗胶片，应用彩色图像摄录输入仪及全自动图像分析仪Multi-Gauge 3.0软件分析蛋白条带密度值，以β-actin作为内参照，计算蛋白相对表达水平。

3.3荧光染色和流式细胞术测定β2AR的表达 (1)Early-EPCs(1× 105)用2% BSA封闭30 min，加入鼠抗mAb-β2AR孵育40 min，再加入兔抗鼠IgE-PE，室温孵育40 min，同时加入DAPI(5 mg/L)20 min，用PBS清洗2次，放在倒置荧光显微镜下观察。(2)Early-EPCs(1× 105)用2% BSA封闭30 min后，加入鼠抗人mAb-β2AR Ⅰ抗，孵育40 min后，再加入山羊抗鼠IgE-APC Ⅱ抗孵育 30 min，用PBS清洗2次，每次5 min，流式细胞术检测。

4 Transwell实验检测early-EPCs的迁移能力

用含0.1% FCS的EBM-2培养基调整细胞数，以每孔3×104early-EPCs/200 μL加入Transwell上室中，下室加入0.1% FCS 的EBM-2培养基 500 μL 及100 μg/L 基质细胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor 1α,SDF-1α)。细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱，2 h 后收集下室的细胞并计数。

5 siRNA的转染步骤

用LipofectamineTM2000 (Lip02000)于24孔细胞培养板转染siRNA。转染前1 d，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入无抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30%～50%汇合度；对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA-Lipo2000混合液： 用 50 μL不含血清的培养基 Opti-MEM®Ⅰ(v2) 稀释 25 pmol siRNA(加入细胞中的 RNA终浓度为50 nmol/L)，轻轻混匀，室温孵育5 min；用50 μL不含血清的培养基Opti-MEM® I (v2) 稀释1 μL Lipo2000，轻轻混匀并室温孵育 5 min； 将两者轻轻混匀，室温孵育 20 min。将siRNA-Lipo2000混合液加入含有细胞以及培养液 (v1) 的培养板各孔中，轻轻混匀，置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养 24～96 h。培养 4～6 h 后，将孔里含有siRNA-Lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基。

6 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 16.0统计软件处理，两组间均数比较采用配对t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 细胞培养 early-EPCs的形态

显微镜下观察early-EPCs形似淋巴细胞，核大，胞浆少，呈集落样生长。EPCs为贴壁细胞，接种后24 h基本全部贴壁生长，大概10 d后细胞在培养皿中长成梭状致密单层，已基本上饱和，需要传代，见图1。

Figure 1. Culture and identification of early-EPCs. A: a colony of early-EPCs in COPD group after 48 h of culture (×20); B: early-EPCs were simultaneously labeled with DiI-acLDL (red) and UEA-1-FITC after 10 d of culture (×40).

2 β2AR mRNA及蛋白在early-EPCs的表达

COPD组和对照组early-EPCs，不加入逆转录酶者，未检到 β2AR 和 β-actin 条带，说明实验用的mRNA没有基因组DNA的污染。加入逆转录酶者的目的条带283 bp处均可见特异性β2AR mRNA表达,COPD组细胞 β2AR mRNA的表达强于对照组细胞，见图2A。COPD组和对照组的 early-EPCs 均可检出分子量约为56～85 kD的 β2AR 蛋白条带。经图像分析软件分析，以β-actin标准化后的COPD组early-EPCs 其β2AR蛋白表达强度高于对照组细胞(P<0.05)，见图2B。用流式细胞术观察可见COPD组和对照组的 early-EPCs均有 β2AR表达，其阳性率分别为82.9%和55.7%，见图2C。

Figure 2. β2AR were expressed on the early-EPCs from the peripheral blood of COPD patients or control subjects. A: β2AR mRNA in early-EPCs from the COPD patients and the control subjects were detected by RT-PCR as gel electropherogram and quantification; B: the protein levels of β2AR in the early-EPCs from the COPD patients and the control subjects were determined by Western blotting; C: the expression of β2AR in the early-EPCs were analyzed by FACS in COPD group and control group. Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control.

3 β2AR在early-EPCs的分布

在荧光显微镜下对COPD组和对照组的 early-EPCs进行观察，可见两组细胞均表达 β2AR。COPD组 β2AR 的荧光强度明显高于对照组，呈现两极分布，见图3。

Figure 3. Distribution of β2AR in the early-EPCs of COPD patients or control subjects(×200). Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control.

4 ICI118551和去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)对early-EPCs迁移功能的影响

为了减少多次实验对结果的影响，空白对照组采用同一实验得出的结果。

4.1不同浓度的ICI118551对early-EPCs迁移的影响 COPD组及对照组的early-EPCs分别与ICI118551(0、5、10、15 nmol/L)孵育24 h后，经过2 h迁移，下室细胞计数表明，COPD组迁移的细胞数明显少于对照各组(P<0.05)。当ICI118551 为10 nmol/L时，COPD组与对照组的迁移细胞数没有明显差异(P>0.05),见图4。

4.2不同浓度的NE对early-EPCs迁移的影响 COPD组及对照组的early-EPCs分别与不同浓度的NE(0、50、100、150 nmol/L)在37 ℃、5% CO2孵育24 h后，经过2 h迁移，可见随着NE的浓度升高，抑制细胞迁移的效应增强，见图5。

Figure 4. Number of migratory early-EPCs treated with ICI118551 at different concentrations (0,5,10 and 15 nmol/L) for 24 h.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control; △P<0.05 vs COPD at baseline concentration (0 nmol/L).

Figure 5. Number of migratory early-EPCs treated with NE at different concentrations (50, 100 and 150 nmol/L) for 24 h.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control; △P<0.05 vs COPD at baseline concentration (0 nmol/L).

5 β2AR单克隆抗体(monoclonal antibody of β2AR,mAb-β2AR)对early-EPCs迁移的影响

5.1不同浓度的mAb-β2AR对early-EPCs迁移的影响 COPD组及对照组的early-EPCs分别与不同浓度的mAb-β2AR(0、1∶100、1∶150、1∶250和1∶300)在37 ℃、5% CO2孵育24 h后，经过2 h迁移，行下室细胞计数，可见用mAb-β2AR封闭细胞的β2AR有助于提高细胞的迁移能力，且mAb-β2AR的浓度是1∶250时，两组的迁移细胞数量无明显差别(P>0.05),见图6。

Figure 6. Number of migratory early-EPCs treated with mAb-β2AR at different concentrations (1∶100, 1∶150, 1∶250 and 1∶300) for 24 h.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control; △P<0.05 vs COPD at baseline concentration (0).

5.2mAb-β2AR与ICI118551和NE共同作用下对early-EPCs迁移的影响 将COPD组及对照组的early-EPCs先与mAb-β2AR(1∶250)共同孵育40 min (37 ℃、5% CO2)后，再与ICI118551(10 nmol/L)或NE(100 nmol/L)共同孵育24 h，经2 h迁移，行下室细胞计数，可见COPD组不同处理组与对照组之间的细胞迁移数之间无明显差异(P>0.05)，在COPD组之间的细胞迁移数也无明显差异(P>0.05)，见图7。

6 RNA干扰下调β2AR在early-EPCs的表达对细胞迁移的影响

经72 h 转染siRNA(转染率70%)，收集细胞，在Transwell上室培养2 h 后收集下室的细胞并计数,发现COPD组下调β2AR表达后，其early-EPCs的迁移能力得到改善，见图8。

讨 论

本实验中我们发现，COPD组的early-EPCs β2AR mRNA表达强于对照组。Western blotting结果示：以β-actin标准化后，COPD组细胞的β2AR蛋白表达强度明显高于对照组(P<0.05)。流式细胞术检测COPD组及对照组的early-EPCs 其β2AR的表达分别为82.9%和55.7%。COPD组的early-EPCs对SDF-1α迁移的细胞数量明显少于对照组(P<0.05)。应用不同浓度的β2AR阻滞剂ICI 118551 作用于COPD组的early-EPCs 24 h，COPD组的early-EPCs对SDF-1α(100 μg/L)迁移的数量均有所提高，其中当 ICI118551 浓度达10 nmol/L时，细胞迁

Figure 7. Effects of mAb-β2AR (1∶250) combined with NE (100 nmol/L) or ICI118551 (10 nmol/L) on the migration of early-EPCs.Mean±SD.n=6.

Figure 8. Effect of knockdown of β2AR expression by RNA interference on the migration of the early-EPCs to SDF-1α.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control; △P<0.05 vs COPD.

移数量增加最明显(P<0.05)。将COPD组的early-EPCs与不同浓度NE共同孵育24 h 后，细胞的迁移数量均不同程度地减少，与NE浓度呈负相关。β2AR抗体可使COPD组的early-EPCs迁移细胞数增加。将COPD组的early-EPCs与mAb-β2AR (1∶250)孵育40 min 之后，再分别与β2AR激动剂(NE 100 nmol/L)、阻滞剂 ICI118551 (10 nmol/L)作用，各组间的迁移细胞数无明显差异。这表明β2AR被抗体封闭后，细胞迁移受到影响。通过下调β2AR的表达，能增加细胞的迁移能力。

β2AR是一种广泛分布在人体组织的肾上腺能受体，调节着机体多种生理功能。β2AR在交感神经作用下，调节细胞迁移和增殖[9]。有研究显示[7,10]，β2AR激动剂加速细胞迁移，在一定程度上抑制细胞增殖，改变β2AR的表达将影响细胞的增殖和迁移功能[11-12]。骨髓内表达CD34+的干细胞归巢受交感神经调节[7-8]。幼稚CD34+干细胞表达β2AR，通过β2AR激活，使细胞膜金属基质蛋白酶活化，分泌金属蛋白酶，引起骨髓微环境中起抑制外流作用的基质膜破坏，促进CD34+干细胞外流。应用相应受体阻滞剂，细胞的外流过程受到抑制。β2AR可在交感神经作用下，促进T淋巴细胞迁移，β2AR激动剂可加速细胞迁移[7, 10]。本实验发现：在COPD组的外周EPCs上有β2AR表达，明显高于对照组，其迁移能力较低，与过高β2AR表达有关，应用β2AR抗体、阻滞剂后，EPCs的迁移功能有所改善，这与Goncharova等[13]报道的关于β2AR 激动剂能选择性抑制HASM细胞的迁移，长期应用β2AR激动剂对细胞迁移的抑制作用降低的结果相一致。当应用β2AR抗体封闭β2AR时，再给于β2AR激动剂或阻滞剂处理，细胞的迁移数量无明显差异，进一步说明β2AR表达对COPD组的early-EPCs的迁移起着非常重要作用，且与β2AR的密度改变有关。而COPD组急性发作期血浆中去甲肾上腺素水平增高[14]，加之治疗期间患者间断应用β2AR激动剂，可能会通过改变β2AR的功能变化，进而影响early-EPCs的迁移功能。另外，COPD组血浆中的细胞因子及毒素(TNF-α、IL-1、LPS)能改变细胞上β2AR的表达，改变细胞的迁移能力[15-16]。

因此，我们推测COPD组的呼吸系统反复发生炎症反应，引起肺组织中细胞因子水平增高，当外周血中的EPCs进入肺组织，在肺内“停留”，部分细胞因子及外源性β2AR激动剂可能会改变EPCs上β2AR的表达数量与受体活性，造成COPD组的EPCs上β2AR mRNA及蛋白的表达水平明显高于对照组，干扰EPCs由肺组织向外周血中进一步迁移，造成外周血中细胞数量降低，同时通过β2AR数量或活性变化导致下游受体活性异常，激活相应信号通路，造成EPCs迁移功能异常，受损血管内皮处的EPCs数量下降，影响修复，导致血管内皮功能异常，加速动脉硬化，促进COPD患者心血管疾病发病率升高[17-18]。

本研究的意义在于，应用β2AR阻滞剂或抗体能够提高COPD患者外周血中early-EPCs迁移功能。通过基因干扰技术下调COPD组early-EPCs的β2AR表达，可改善细胞迁移能力，将为临床上预防COPD患者心血管疾病的发生提供理论依据。但β2AR是如何改变COPD患者血中EPCs迁移能力，仍需进一步研究。

[参 考 文 献]

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