复方枇杷桔梗膏质量标准研究

谢周涛，胡 进

（湖北省新华医院药学部，湖北 武汉 430015）

复方枇杷桔梗膏由枇杷叶、罂粟壳、桔梗、薄荷脑等9味中药组方，具有养阴敛肺、祛痰镇咳的功效，用于久咳劳嗽、上呼吸道炎、支气管炎引起的咳喘痰饮等症。罂粟壳为方中主药，吗啡为其主要成分之一[1－3]，但具有成瘾性，必须控制其含量。为控制该制剂质量，保证临床疗效，本试验中采用薄层色谱（TLC）法对方中枇杷叶、罂粟壳、桔梗、薄荷脑进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定制剂中吗啡的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

戴安summit P680型高效液相色谱仪，summit P680A型低压四元泵，PDA100型二极管阵列检测器，ASI100型自动进样器，summit柱温箱，Chromeleon色谱工作站，UV－3300型扫描型紫外／可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。固相小柱（十八烷基硅烷键和硅胶为填充，填充物250 mg，容积6 mL，天津市琛航科技仪器有限公司）；AB－265s型梅特勒（十万分之一）分析天平。吗啡对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号为171201－200419）；枇杷叶对照药材（批号为 121261－0301）；罂粟壳对照药材（批号为110722－200309）；桔梗对照药材（批号为121028－200907）；薄荷脑（批号为 0728－200005）；复方枇杷桔梗膏（本医院制剂，批号分别为 100921，100922，100923，100931，100932，100933）；乙腈（色谱纯，天津康巢正兴科技有限公司），水为双重蒸馏水，磷酸二氢钾、庚烷磺酸钠（分析纯，天津大茂化学试剂厂），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

枇杷叶：取样品10 g，加水40 mL，搅匀，用乙醚振摇萃取3次，每次40 mL，乙醚层备用；合并水层，加0.5 g氢氧化钠使溶解，摇匀，水层溶液加水饱和的正丁醇提取4次，每次30 mL；合并正丁醇液，水洗至中性，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取枇杷叶对照药材 1 g，加水 100 mL，煎煮 30 min，滤过，滤液加氢氧化钠配成1%的浓度，滤液按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。取缺枇杷叶的阴性样品，同法制得阴性对照品溶液。照TLC法[2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一以0.4%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿－醋酸乙酯－甲醇－水（16 ∶38 ∶22 ∶9）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 5% 磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱和对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性对照品溶液无干扰(见图1A)。

罂粟壳：取样品15 g，加氨试液调pH至10，用三氯甲烷萃取3次，每次30 mL，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取罂粟壳对照药材1.5 g，加水30 mL煎煮30 min，滤过，取滤液，同法制成对照药材溶液。取缺罂粟壳的阴性样品，同法制得阴性对照品溶液。照TLC法[2010年版《中国药典（一部）》附录Ⅵ B]试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一以0.4%羧甲基纤维素钠为黏合剂含2%氢氧化钠制备成的硅胶G薄层板上，以甲苯－丙酮 －乙醇－浓氨试液（20∶19∶3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾溶液。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液无干扰(见图1B)。

桔梗：取样品15 g，加水40 mL，搅匀，用乙醚振摇萃取3次，每次40 mL，合并水层，用盐酸试液调节 pH至3，再用乙酸乙酯萃取2次，每次40 mL，分取乙酸乙酯层，合并，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取桔梗对照药材3 g，碾细，加水，超声提取30 min，离心，过滤，取滤液浓缩成浸膏，取2 mL浸膏，同法制成桔梗对照药材溶液。另取桔梗阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。照TLC法[2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB]试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一用0.3%氢氧化钠调制的硅胶薄层板上，以正己烷－氯仿－甲醇（15∶11∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷25%磷钼酸乙醇溶液后105℃显色，供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性对照品无干扰(见图1C)。

薄荷脑：取枇杷叶项下的乙醚提取液，挥干乙醚，残渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取薄荷脑对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含0.5 mg薄荷脑的溶液，作为对照品溶液。取缺薄荷脑的阴性样品，同法制得阴性对照品溶液。照TLC法[2010年版《中国药典（一部）》附录Ⅵ B]试验，吸取上述 3种溶液各10 μL，分别点于同一以0.4%羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷－乙酸乙酯（9∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照品溶液无干扰(见图1D)。

图1 薄层色谱图

2.2 吗啡含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol／L 磷酸二氢钾水溶液 －0.002 5 mol／L 庚烷磺酸钠水溶液 －乙腈（44 ∶44 ∶12）；检测波长：220 nm；柱温：25 ℃。理论板数按吗啡峰计算应不低于1 000。

2.2.2 溶液配制

精密称取在105℃干燥1 h的吗啡对照品适量，加30%甲醇和5%醋酸溶液制成每l mL含无水吗啡10 μg的溶液，作为对照品溶液。取以十八烷基键合硅胶为填充剂的固相小柱1支，依次用甲醇 －水（3∶1）混合溶液 15 mL及水 5 mL冲洗，再用 pH为9的氨试液50 mL冲洗备用。取本品20 g，精密称定，置50 mL棕色瓶中，加5%醋酸溶液约25 mL，超声10 min后加5%醋酸溶液至刻度，摇匀，离心10 min；精密移取离心上清液2 mL，置上述固相小柱上，加氨试液5 mL，待溶液滴尽后用水20 mL冲洗，再用5%醋酸溶液洗脱，用5 mL量瓶收集洗脱液至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.2.3 方法学考察

阴性干扰试验：取阴性样品，按照供试品溶液的制备方法制得阴性对照品溶液。在选定的色谱条件下进样测定，记录色谱图。结果表明，阴性对照品溶液色谱在与吗啡对照品溶液色谱峰相应位置未检测出色谱峰，表明处方中其他药物对吗啡的测定无干扰，该方法有较好的专属性。色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图

线性关系考察：精密称取吗啡对照品10.23 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。精密量取上述贮备液 5 mL，分别置 10，25，50，100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度分别为 102.30，40.92，20.46，10.23 μg ／mL 的对照品溶液，再分别精密量取上述质量浓度为 10.23 μg／mL 的对照品溶液 5 mL，置 10，25 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度分别为 5.115，2.046 μg ／mL的对照品溶液。在选订的色谱条件下分别进样10 μL，记录各色谱峰峰面积，以峰面积（Y）均值为纵坐标、进样量（X）为横坐标绘制标准曲线，回归方程为 Y＝126.414 6 X－1.317 1，r＝0.999 7（n＝6）。结果表明，吗啡进样量在 0.020 4～1.023 μg之间与峰面积具有良好线性关系。

精密度试验：精密吸取对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定峰面积。结果峰面积平均值为 13.584 3，RSD ＝1.16% （n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批号（100921）的样品6份，依法制备供试品溶液并分别测定。结果吗啡平均含量为 74.54 μg／g，RSD＝1.66% （n＝6），表明该方法重现性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，于 0，1，2，4，6，8 h 时分别进样 10 μL测定。结果吗啡峰面积平均值为13.765 2，RSD＝1.34%（n＝6），表明吗啡溶液在 8 h时内基本稳定。

加样回收试验：取已知含量的同一批样品(批号为100921，吗啡含量为 74.54 μg／g）6 份，各约 10 g，精密称定。另取吗啡对照品适量，精密称定，置50 mL容量瓶中，加5%醋酸溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀。分别精密移取对照品溶液，置上述供试品溶液中，照供试品溶液的制备方法操作，分别进样测定。结果见表1。

表1 吗啡加样回收试验结果(n＝6)

2.2.4 样品含量测定

取本品6批样品，依法制备供试品溶液并测定吗啡含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

取吗啡对照品溶液，置紫外分光光度仪于200～400 nm波长范围内扫描，结果吗啡在220.7 nm波长处有最大吸收，与2010年版《中国药典（一部）》罂粟壳含量测定波长相近，故选择220 nm为测定波长。

曾选用 0.5% 乙酸氨 － 甲醇（9 ∶1）、0.01 mol／L 磷酸氢二钾溶液 －0.005 mol／L 庚烷磺酸钠水溶液 －乙腈（40 ∶40 ∶20）、0.05 mol／L 磷酸二氢钾溶液 －0.002 5 mol／L 庚烷磺酸钠水溶液 －乙腈（42 ∶42 ∶16；44 ∶44 ∶12）作流动相，分别进样测定，结果用 0.05 mol／L磷酸二氢钾溶液 －0.002 5 mol／L庚烷磺酸钠水溶液 －乙腈（44∶44∶12）为流动相分离效果较理想[4]，供试品溶液色谱中吗啡能与其他组分达到基线分离，测得吗啡峰面积最大。

对液液萃取法和固相小柱萃取法进行比较，后者制备样品中吗啡的含量高于前者。中药膏剂含糖量较高、粘度大，且固相小柱萃取效果好、方法简便，故本试验选择固相小柱萃取法作为供试品溶液的制备方法[5]。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：283.

[2]郑宏钧.现代中药材鉴定手册[M].第11版.北京：中国医药科技出版社，2001：489.

[3]苗明三，李振国.现代实用中药质量控制技术[M].北京：人民卫生出版社，2000：1 090.

[4]康小玉，钱思明.RP－HPLC测定洋参保肺糖浆中吗啡的含量[J].中成药，2000，22（11）：762 － 763.

[5]覃志高，李如栋，陈志华.复方甘草片含量测定方法改进[J].中国药业，2009，18（16）：31.