子宫颈环形电切术及冷刀锥切术治疗宫颈上皮内瘤变2～3级效果比较

王宁宁，花茂方

（1.连云港市第一人民医院妇科，江苏连云港222000；2.连云港市妇幼保健医院妇产科，江苏连云港222000）

张润娉，李建平

（苏州高新区人民医院神经内科，江苏苏州215129）

子宫颈环形电切术及冷刀锥切术治疗宫颈上皮内瘤变2～3级效果比较

王宁宁1，花茂方2

（1.连云港市第一人民医院妇科，江苏连云港222000；2.连云港市妇幼保健医院妇产科，江苏连云港222000）

目的：比较宫颈冷刀锥切术（cold knife conization，CKC）和宫颈环行电切除术（loop electrosurgical excision procedure，LEEP）治疗宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）2～3级的临床价值。方法：回顾性分析172例CIN 2～3级患者的临床资料，通过观察CKC和LEEP两种宫颈锥切术治疗CIN 2～3级的临床疗效，比较二者的临床价值。结果：与CKC组相比，LEEP组手术时间短，术中平均出血量少，术后出血发生率及宫颈管黏连率低，术后病变复发率高，术后高危人乳头瘤病毒（HPV）清除率低（P均＜0.05）。CKC组术后病灶残留率低于LEEP组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。两组患者手术后高危HPV感染均较术前明显下降。术后病理显示，LEEP组病变复发患者均为CIN 3级，80%标本为多象限受累，病变残留占60%。结论：LEEP手术时间短、术中出血少、术后并发症少，但在减少复发（尤其是病变级别高，标本多象限受累的情况）及高危HPV持续感染方面不及CKC，因此LEEP尚不能完全取代传统的CKC。

宫颈上皮内瘤变；宫颈冷刀锥切术；宫颈环形电切除术

子宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是与子宫颈浸润癌密切相关的一组子宫颈病变，常发生于25～35岁女性。大部分低级别CIN可自行消退，但高级别CIN具有癌变潜能，可发展为浸润癌，被视为癌前病变。约60%CIN 1级会自然消退，约20%CIN 2级会发展为CIN 3级，5%发展为浸润癌。故所有的CIN 2级、3级均需要治疗。CIN反映了子宫颈癌发生发展中的连续过程，通过筛查及时发现CIN和治疗高级别病变，是预防子宫颈癌行之有效的措施。阴道镜检查满意的CIN 2级可用物理治疗或子宫颈锥切术；阴道镜检查不满意的CIN 2级和所有的CIN 3级通常采用子宫颈锥切术，包括子宫环形电切术（loop electrosurgical excision procedure，LEEP）和冷刀锥切术（cold knife conization，CKC）［1］。本研究通过对CKC和LEEP治疗CIN 2～3级临床疗效的观察及对比，探讨两种宫颈锥切术治疗CIN 2～3级的临床价值。

1 对象与方法

1.1 病例

回顾性分析2010年1月至2013年6月在连云港市第一人民医院及连云港市妇幼保健医院门诊经薄层液基细胞学检查（thinprep cytologic test，TCT）、阴道镜辅助下行宫颈多点活检术＋颈管诊刮术，经过病理检查，诊断为CIN 2～3级的已婚患者172例，年龄23～57岁，平均年龄42.6岁，高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）检测均为阳性。随机分为2组，其中，行CKC 112例，行LEEP 60例。两组患者年龄、妊娠次数差异均无统计学意义；均于月经干净3～7 d后手术；宫颈锥切术前均行血常规，血凝常规，白带常规，肝肾功能，心电图检查，均无手术禁忌证。术后随访1～2年。

1.2 方法

1.2.1 CKC操作方法 患者术前行腰麻、腰硬联合或全身麻醉，取膀胱截石位，常规消毒大腿内上1／3，外阴和阴道铺无菌巾。再次消毒阴道、宫颈，置入窥阴器扩张阴道显露宫颈。用宫颈钳钳夹宫颈前唇外壁或用7号丝线缝宫颈前后唇做牵引。探查宫腔了解子宫位置及深度。于宫颈3点、9点近穹窿处黏膜下注射垂体后叶素稀释液（6 U溶于30～50 mL生理盐水）或1∶300肾上腺素盐水以防出血（心血管疾病患者忌用）。宫颈表面涂碘液，观察碘染部位和范围。用小尖刀在宫颈表面碘不着色区外0.3～0.5 cm处做一环形切口，一般以30～50°斜向颈管行宫颈锥形切除，切除深度一般为2～2.5 cm，不超过宫颈内口，切除的宫颈呈圆锥状。宫颈残端处理采用Sturmdorf改良缝合法［2］，以1-0可吸收线行宫颈残端缝合，使宫颈成型。锥切较浅，出血不多时可不缝合，用凝血纱布或明胶海绵加止血粉贴于创面，碘仿纱条或纱布填塞，压迫止血，48 h后取出。术毕用探针和小号扩张器探宫腔深度和扩张宫颈管。阴道内填塞纱布压迫止血，术后平卧，保留导尿48～72 h。术后第5天出院。

1.2.2 LEEP操作方法 取膀胱截石位，常规消毒大腿内上1／3，外阴及阴道铺无菌巾。再次消毒阴道、宫颈，置入窥阴器扩张阴道显露宫颈。于宫颈3、6、9点注射2%利多卡因进行局部麻醉。宫颈表面涂碘液，明确病变范围。采用美国WALLACH公司生产的高频电刀，电切割输出功率为50W，电凝止血输出功率为25W，采用环形电极、条形电极或球形电极等切割、止血。观察病变大小选择合适的电切环型号，以单次切除整个病变和移行带为标准，自不着色区域外0.3 cm处，宫颈12点处切入，电环顺时针方向匀速切除病灶。切除宫颈管深度根据具体情况而定，一般锥高1.5～2.0 cm。术中出血极少，电凝止血效果满意。创面用无菌纱布压迫24 h后取出。CKC及LEEP两组术后标本12点处缝线标记后均行病理学检查。

1.2.3 术后处理及并发症 术后1周内禁止剧烈活动，保持外阴清洁，禁止性生活及盆浴3个月，CKC组术后静滴抗生素3～4 d，LEEP组术后口服抗生素3 d。观察两组可能出现的并发症：术后阴道大量出血（相当或多于月经量）、感染及宫颈口黏连，出现并发症的患者应及时对症治疗。

1.2.4 随访 所有患者均为门诊随访。随访时间为术后第1年每3月1次，第2年每半年1次，两年内如无异常，每年1次。随访内容为所有患者均行TCT检查，高危HPV检测；如TCT异常，行阴道镜下宫颈活检术及病理学检查。

1.2.5 观察指标 观察两组的手术时间、术中出血量、术后出血发生率、术后宫颈管黏连率、高危HPV清除率、术后病灶残留率、复发率。术后3月发现CIN为手术病灶残留；手术后无CIN病灶残留，半年后发现CIN为病变复发；术后半年检查无CIN为治愈。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。两组间手术时间和术中平均出血量的比较采用t检验，两组术后阴道大出血、术后宫颈黏连、术后残留、术后病变复发率的比较采用Fisher′s确切概率法，两组间高危HPV清除率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组术中情况比较

LEEP组平均手术时间，术中平均出血量均明显优于CKC组（P均＜0.01）。见表1。

表1 两组术中情况比较 ±s

表1 两组术中情况比较 ±s

组别 n 手术时间（min）术中平均出血量（mL）112 24.00±5.26 28.02±4.81 LEEP组 60 5.00±2.66 6.07±3.69 t值CKC组26.32 30.83 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.2 两组术后并发症观察指标比较

结果显示，CKC组术后阴道大出血、术后宫颈黏连等发生率均高于LEEP组（P均＜0.05）；两组术后残留相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 两组治疗效果的比较

见表3。CKC组术后病变复发率明显低于LEEP组（P＜0.05），但高危HPV清除率则高于LEEP组（P＜0.01）。由于术前两组高危HPV感染均为阳性，术后CKC组高危HPV感染率降为8.93%（10／112），LEEP组高危HPV感染率降为26.67%（16／60），均较术前大幅度下降。病理检查结果发现，两组病变复发患者均为CIN 3级，LEEP组5例复发患者中3例为术后残留者，占60%，LEEP组复发患者中80%为标本多象限受累。

表2 两组术后并发症情况比较

表3 两组治疗效果的比较

3 讨论

近年来，随着宫颈细胞学检查的大规模开展与普及和阴道镜下活检的联合应用，CIN及宫颈癌的检出逐年增多，且发病年龄日趋年轻化。由于CIN本身并不具有恶性肿瘤的生物学特性，所以其治疗完全是去除病灶而不过度损伤正常的宫颈组织［3］。2001年美国阴道镜和宫颈病理协会（ASCCP）推荐的CIN 2～3级主要治疗方法为宫颈锥切术，包括LEEP和CKC［4］。

CKC于1834年由Lisfranc首次报道，我国于20世纪50年代开始应用，现已成为一种成熟的治疗CIN的经典方法［5］。CKC能够提供足够的、完整的手术标本，可较为充分地了解病理分级，病变范围及程度，既可充分地去除病灶、达到满意地治疗宫颈病变的目的，同时又保留生育功能。LEEP是近20年来发展起来的一种新型手术，对组织的高温破坏极小，避免了影响切口边缘组织的病理学检查［6］。LEEP是采用金属环通以高频电流对宫颈组织进行锥形切除，最早于1981年由Cartier报道，与传统CKC相比，手术操作简便、无需麻醉、出血少、创面无需缝合［5］。

本研究结果表明，与CKC组相比，LEEP组手术时间短、术中出血量少；且LEEP组术后阴道出血及宫颈黏连等并发症发生率低（P＜0.05）。CIN的治疗效果通常从宫颈病灶切除的彻底性和术后复发的情况来评价，术后观察病变持续或复发非常重要。目前，评价的常用观察指标有病灶残留率、复发率、高危HPV清除率等。Huang等［7］研究116例CIN，其中，73例行LEEP术，43例行CKC术，6个月后均行子宫切除，结果显示LEEP与CKC在术后残留方面差异无统计学意义。本研究结果显示，CKC组术后残留低于LEEP组，但差异无统计学意义（P＞0.05），结果与Huang等观点相同。CKC组病变复发率明显低于LEEP组，并且病理显示，LEEP组病变复发患者均为CIN 3级，其中病变残留占60%，80%为标本多象限受累，提示病变级别高（即CIN3级），标本多象限受累，病变范围大，病灶残留，可能导致CIN持续、复发，这与Siriaree等［8］观点一致。

宫颈癌起源于CIN，两者病因相同，均为高危型HPV感染所致，接近90%的CIN和99%以上的宫颈癌组织有高危型HPV感染［1］。因此，术后长期存在的高危型HPV感染势必增加CIN复发的可能。本文结果表明，两组患者手术后高危型HPV感染均较手术前明显下降，提示宫颈锥切术在去除CIN病灶的同时，在很大程度上也能清除病毒感染。CKC组术后高危型HPV清除率明显高于LEEP组，提示CKC比LEEP具有更强的病毒清除能力，可能与CKC切除范围较大有关。

因此，我们认为LEEP组与CKC组治疗效果的差异与下列因素有关：CIN病变级别高（CIN 3级），病灶呈多象限受累，宫颈病变范围大的患者，术后更易复发；LEEP术切除宫颈锥高度一般为1.5～2 cm，手术范围较CKC小（切除高度2.0～2.5 cm），取材相对有限，可能遗漏病灶，尤其对CIN病变级别高，病灶呈多象限受累的病灶不易根治，导致HPV病毒持续感染，清除率低；术者的操作经验、手术技巧、手术方式选择对治疗效果也存在影响。可见，CKC在控制病变复发率和提高HPV清除率方面较LEEP更具优势，病变级别高（CIN 3级）、标本多象限受累的患者，宜选择CKC治疗，这与文献观点一致［9－10］。

综上所述，LEEP治疗CIN 2～3级具有手术时间短、术中出血少、术后并发症发生率低等优势，但在控制病情复发，尤其是因病变级别高（CIN 3级），标本多象限受累而致复发可能性大的患者，清除HPV病毒感染等方面存在局限性，无法完全代替传统的CKC。临床上应根据患者病情特点、病变范围，合理选择宫颈锥切术的方式，进行个体化治疗，同时还要不断提高两种锥切术的手术技巧，既要尽量减小创伤，保留正常组织，又要防止手术不足造成CIN的残留或复发，高度重视术后随访，才能最大限度地降低手术对患者生活质量及生育功能的影响。

［1］谢幸，苟文丽.妇产科学［M］.8版.北京：人民卫生出版社，2013：301－304.

［2］张志毅，章文华.现代妇科肿瘤外科学［M］.北京：科学出版社，2003：78.

［3］干晓琴，张凌，林海，等.冷刀锥切术或LeeP术治疗164例CIN 2～3的临床分析［J］.四川医学，2010，31（5）：558－560.

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［6］连丽娟，林巧稚.妇科肿瘤学［M］.4版.北京：人民卫生出版社，2006：335.

［7］Huang LW，Hwang JL.A comparison between loop electrosurgical excision procedure and cold knife conization for treatment of cervical dysplasia：residual disease in a subsequenthysterectomyspecimen［J］.Gynecol Oncol，1999，73（1）：12－15.

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阿米洛利通过自噬溶酶体途径保护PC12细胞

张润娉，李建平

（苏州高新区人民医院神经内科，江苏苏州215129）

［摘要］目的：研究酸敏感离子通道阻断剂阿米洛利对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株的保护作用及其对自噬溶酶体通路的影响。方法：在PC12细胞模型上，观察甲基苯基吡啶（methy-phenylpyridi，MPP＋）处理对细胞存活率（MTT检测）、乳酸脱氢酶（LDH）漏出率、细胞凋亡率的影响，并观察阿米洛利对MPP＋所致细胞死亡的影响；蛋白质印迹法检测大自噬通路标志蛋白LC3和分子伴侣介导的自噬通路标志蛋白LAMP2a表达水平的变化。结果：MPP＋导致细胞存活率明显降低，上清液中LDH漏出率明显升高，细胞凋亡率升高，抑制大自噬通路标志蛋白LC3-Ⅱ的表达，同时上调了分子伴侣介导的自噬通路标志性蛋白LAMP2a的表达水平；而阿米洛利可提高细胞存活率，减少上清液中LDH漏出率，降低细胞凋亡率，并能在激活大自噬通路的同时下调分子伴侣介导的自噬通路的活性。结论：阿米洛利可能通过抑制酸敏感离子通道的作用拮抗MPP＋诱导的PC12细胞自噬性死亡。

［关键词］阿米洛利；PC12细胞；MPP＋；自噬 溶酶体通路

DOI：10.13312／j.issn.1671-7783.y1400126

［Abstract］Objective：To evaluate the neuroprotective effects of amiloride；a non-selective blockers of acid-sensing ion channels，on PC12 cells and to view the influence of autophagy-lysosome pathway（ALP）.M ethods：PC12 cells were tested with methy-phenylpyridi（MPP＋），while giving amiloride as interventiong：The cells viabilitywas analyzed by MTT assay；The cells injury was assessed by lactate dehydrogenase（LDH）assay；Flow cytometry was used to study the apoptotic；Western blot analysis was used to study the autophagic mechanisms.Results：MPP＋medium treatment resulted in significantly lower survival rate，the supernatant of LDH leakage was significantly higher，the apoptosis rate increased，the expression of LC3-Ⅱwas inhibited while inducedmore expression of LAMP2a；but amiloride effectively improved the cell survival rate，reduced LDH leakage rate，inhibited apoptosis，and upregulated LC3-Ⅱprotein，which is associated decrease expression of LAMP2a.Conclusion：Amiloride can protect PC12 cells againstMPP＋-induced cell death by autophagic，through inhibition of acid-sensing ion channels activity.

［Key words］amiloride；PC12 cells；MPP＋；autophagy-lysosome pathway

帕金森病是一种常见于中老年人、以黑质多巴胺能神经元进行性丢失和纹状体内多巴胺 乙酰胆碱平衡紊乱为特征的神经变性疾病。随着人口老龄化的出现，帕金森病已成为影响人类健康的主要疾病之一。研究发现，蛋白质的异常聚集在帕金森病发病过程中具有重要作用，而自噬溶酶体途径（autophagy-lysosome pathway，ALP）是细胞降解蛋白的主要途径，提高ALP活性可减少帕金森病中异常蛋白的聚集［1］。

酸敏感离子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）为选择性的离子通道蛋白，表达于中枢及周围神经系统，广泛参与到体内炎症、疼痛、癫痫、脑缺血缺氧、神经细胞死亡等病理过程。有研究显示，在甲基苯基四氢吡啶（methyl-phenyl-tetrahydropyridine，MPTP）诱导的帕金森病模型中应用ASICs阻断剂阿米洛利可发挥神经保护作用［2］，但其机制以及是否与ALP相关仍不明确。本研究通过环境毒素甲基苯基吡啶（methy-phenylpyridi，MPP＋）诱导PC12细胞损伤，并给予阿米洛利进行干预，以探讨ASICs和ALP是否与帕金森病的发病存在联系。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。RPMI-1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、阿米洛利为Sigma公司产品；乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒购自南京建成生物科技公司；凋亡试剂盒（488 Annexin V／PI）为Molecular Probes公司产品；MPP＋（Sigma公司）；细胞裂解液、小鼠单克隆抗β-肌动蛋白抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔及山羊抗小鼠抗体、ECL发光剂等均购自碧云天生物技术研究所；兔多克隆抗LC3抗体、兔多克隆抗LAMP2a抗体均为Abcam公司产品。

1.2 细胞培养及处理

PC12细胞用RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清）培养于25 cm2的培养瓶中，置于5% CO2、饱和湿度、37℃的培养箱内，隔天换液，生长至80%～90%时传代培养。实验前1天，取对数生长期的细胞接种于96孔培养板（7 000个／孔）用于MTT测定，或6孔培养板（2×106个／孔）内用于LDH检测、流式细胞仪检测、蛋白质印迹法分析。细胞稳定生长24 h后，进行实验分组：正常对照组换为新鲜培养基；MPP＋组给予MPP＋（0.5 mmol／L）处理；阿米洛利组则在给予MPP＋的同时加入阿米洛利（100μmol／L）药液。继续培养24 h后，终止培养。

1.3 MTT法检测PC12细胞活性

利用活细胞内琥珀酸脱氢酶能将MTT还原成蓝紫色结晶的特性，以结晶溶解后呈现的颜色深浅反映细胞活性的高低。药物处理24 h，吸除培养液，PBS清洗1次，每孔加入80μL的新鲜培养基和20 μL的MTT溶液（5 mg／mL），37℃避光孵育2 h，1 mL注射器小心吸除上清，每孔加入150μL的二甲基亚砜（DMSO）至沉淀完全溶解，使用全自动酶标仪于570 nm波长处测光密度值（D值），细胞活性用存活率表示，细胞相对存活率（%）＝（实验组平均D值／对照组平均D值）×100%（各孔D值需与凋零孔校对）。

1.4 上清液LDH活性的检测

细胞受损后胞质内的LDH可漏出到培养液中，通过比色法可计算漏出至培养液内的LDH含量。药物处理细胞24 h后，取上清液，离心（4℃，1 000 r／min）5 min，取上清，弃沉淀。除测定管外，每次实验均同时测定标准管（以丙酮酸标准品代替样品）、标准空白管（以双蒸水代替样品）以及空白管（无辅酶）。按LDH试剂盒说明书进行操作。全自动酶标仪于440 nm波长处测各管D值。上清液中的LDH活力（U／L）＝［（测定管D值－测定空白管D值）／（标准管D值－标准空白管D值）］×标准品浓度（2μmol／mL）×1 000 mL。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

本实验使用Annexin V-PI双染色法测定细胞凋亡。药物处理PC12细胞24 h后，胰酶消化收集细胞，制成单细胞悬液。离心（4℃，1 000 r／min）5 min弃上清，预冷PBS洗2次，重悬于100μL结合缓冲液中，各加入5μL的Annexin V和1μL的PI工作液，常温避光反应15 min，加入300μL结合缓冲液，轻柔混匀，流式细胞仪检测约10 000个细胞。计算AV＋细胞（凋亡细胞）百分比。将整个实验重复3次，然后进行统计分析。

1.6 蛋白质印迹法检测LC3和LAMP2a蛋白的表达

药物处理PC12细胞24 h后，用细胞刮刀收集细胞，离心（4℃，1 000 r／min）5 min弃上清，4℃PBS洗2次，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白。经浓度测定及变性后，取30μg总蛋白进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，将胶上蛋白转移至PVDF膜，封闭后分别加入LC3（1∶1 000）、LAMP2a（1∶250）和β-肌动蛋白（1∶1 000）抗体4℃孵育过夜。次日TBST洗3次，加入HRP标记的二抗（1∶1 000）37℃孵育2 h，ECL发光法显影于X光胶片上，扫描仪扫描蛋白条带，Image Tool软件测定免疫印迹条带密度。免疫印迹条带密度＝面积×灰度，每个样本的条带密度与同一样本的β-肌动蛋白进行比较求出比值，整个实验重复3次，进行统计学分析。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 阿米洛利提高MPP＋处理后的PC12细胞的存活率

不同浓度阿米洛利作用于正常PC12细胞后，MTT实验结果显示，200、500μmol／L的阿米洛利可明显降低细胞活性［细胞存活率分别为85.2± 5.0）%、（39.4±6.7）%］；100μmol／L的阿米洛利组细胞存活率为（94.8±9.7）%，与正常PC12细胞的存活率间的差异无统计学意义。

随后观察不同浓度阿米洛利对 MPP＋（0.5mmol／L）处理的PC12细胞存活率的影响，结果显示100、150μmol／L的阿米洛利组细胞存活率分别为（88.78±13.6%）和（98.4±8.9）%，明显高于MPP＋（0.5mmol／L）组PC12细胞存活率［（65.47±9.42）%］，而50μmol／L的阿米洛利组细胞的存活率［（73.18±7.53）%］和MPP＋（0.5mmol／L）组间的差异无统计学意义。

最后观察了100μmol／L阿米洛利对经不同浓度MPP＋（0.5、1.0mmol／L）处理的PC12细胞的影响，结果显示不同浓度MPP＋均可降低PC12细胞的存活率，而100μmol／L阿米洛利可提高不同浓度MPP＋作用的PC12细胞的存活率。见图1。

图1 阿米洛利对不同浓度MPP＋处理的PC12细胞株的保护作用

2.2 阿米洛利降低MPP＋处理的PC12细胞LDH漏出率

对照组细胞上清液中LDH的活性为（423.2± 50.9）U／L，与对照组比较，MPP＋处理细胞24h后，上清液中LDH漏出率明显增加［（567.3±28.1）U／L，t＝5.893，P＜0.001］，而加入100μmol／L阿米洛利后，LDH漏出率［（383.5±12.4）U／L］明显低于其他两组（P＜0.01），提示阿米洛利可有效降低MPP＋诱导的细胞损伤。

2.3 阿米洛利减少MPP＋处理的PC12细胞凋亡率

PC12细胞经AnnexinV／PI双标后，应用流式细胞仪检测凋亡细胞比例。对照组凋亡细胞的比例为（5.8±0.4）%，MPP＋处理细胞24h后，细胞凋亡率升高至（44.3±8.5）%，与对照组间的差异有统计学意义（t＝2.920，P＜0.05）。给予100μmol／L的阿米洛利后，细胞凋亡率为（21.7±1.5）%，与MPP＋组比较，明显降低（t＝6.965，P＜0.01）。

2.4 阿米洛利上调PC12细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达

MPP＋处理后，PC细胞中LC3蛋白的表达水平明显降低，提示大自噬通路的活性受到抑制；阿米洛利干预组LC3-Ⅱ的表达增多，提示阿米洛利可拮抗MPP＋导致的大自噬抑制作用（图2）。

图2 各组PC12细胞LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平

2.5 阿米洛利下调MPP＋处理的PC12细胞LAMP2a蛋白表达

与对照组比较，MPP＋处理明显诱导了LAMP2a表达的上调，提示分子伴侣介导的自噬（chaperonemediatedautophagy，CMA）途径的激活；阿米洛利逆转了这一病理改变，使LAMP2a的表达明显降低，提示其有效抑制了CMA途径的异常激活（图3）。

3 讨论

ALP为胞内蛋白降解的主要途径，分为大自噬（即一般所指自噬）、CMA和小自噬。对异常蛋白清除机制的研究多集中于大自噬及CMA两种，大自噬激活常伴随CMA活性下降［3］。LC3为大自噬的特异性标志蛋白，可分为可溶性（LC3-Ⅰ）和膜性（LC3-Ⅱ），后者能稳定结合在自噬体膜上，存在于自噬体形成的各个阶段，反应大自噬的活动；LAMP2a可识别由CMA特异性识别的异常蛋白，并介导该蛋白进入溶酶体腔内，可反应CMA的活性。自噬降解胞内成分无明显的选择性，主要清除弥散分布于胞质内的异常蛋白［4］，并且这种清除作用独立于其他蛋白降解系统［5］。不同条件下，自噬既可以作为一种防御机制清除胞质内受损的细胞器、代谢产物，进行亚细胞水平上的重构，保护受损的细胞，同时也作为一种细胞死亡程序诱导细胞的主动性死亡。

图3 各组PC12细胞LAMP2a蛋白的表达水平

近年的研究发现，异常蛋白聚集在帕金森病发病过程中具有重要作用［6－7］。帕金森病患者大脑神经元胞质中存在大量由泛素化蛋白聚集形成的包涵体，有研究显示胞质内包涵体本身不会导致神经退行性病变，与其形成密切相关的异常蛋白的弥漫存在才是导致神经元退变的主要原因［4］。应用了自噬诱导剂的PC12细胞中可观察到LC3-Ⅱ表达明显增多，同时观察到各种形式的α-突触核蛋白均明显减少，提示诱导自噬可减少α-突触核蛋白聚集，提高细胞存活率［1，8］。

对帕金森病发病机制的研究还发现ASICs在帕金森病的发病中具有重要作用。比如Pakin基因突变可导致常染色体遗传的帕金森病，pakin蛋白正常情况下可抑制ASICs激活，选择性敲除小鼠海马神经元Pakin基因可增强ASICs电流，促成多巴胺能神经元兴奋性中毒而死亡［9－10］；小鼠中脑切片可见大量ASICs表达，抑制ASICs可减少帕金森病细胞模型中α-突触核蛋白的过度表达［11］。帕金森病、亨廷顿病患者及动物模型脑内存在明显的组织酸化现象，阻断ASIC1a（ASICs在中枢神经系统中的主要表达亚型）的激活或降低其表达均可起到一定的神经保护作用［2，12－13］。

以上发现提示，ASICs和自噬在帕金森病发病过程中可能存在协同作用，但缺乏直接的实验证据。本研究发现，给予MPP＋诱导的帕金森病细胞模型ASICs非选择性抑制剂阿米洛利可明显提高细胞存活率，蛋白质印迹法分别检测大自噬和CMA相关蛋白LC3-Ⅱ和LAMP2a，结果显示阿米洛利能上调LC3-Ⅱ的表达和抑制LAMP2a的过度表达。该研究结果提示ASICs可能参与了ALP途径，而使用ASICs抑制剂可改善自噬受损。

总之，自噬是细胞器和蛋白降解的主要途径，对成熟神经元具有重要的作用，与很多神经系统疾病包括神经退行性疾病［14］、缺血性脑血管病［15］、中枢神经系统感染、癫痫［16］、恶性肿瘤以及肌肉疾病相关。因此，研究ASICs与自噬的关系以及通过ASICs调节自噬功能具有广泛研究及临床应用价值。

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［收稿日期］2014－05－13 ［编辑］陈海林

Comparison of loop electrosurgical excision procedure and cold knife conization in the treatment of cervical intraepithelial neoplasia 2-3

WANG Ning-ning1，HUAMao-fang2
（1.Department of Gynecology，the First People′s Hospital，Lianyungang Jiangsu 222000；2.Department of Gynecology and Obstetrics，Lianyungang Maternal and Child Health Hospital，Lianyungang Jiangsu 222000，China）

Objective：To evaluate the clinical effects of cold knife conization（CKC）and loop electrosurgical excision procedure（LEEP）in the treatment of cervical intraepithelial neoplasia 2-3（CIN2-3）.M ethods：A retrospective analysis of the clinical datawas carried out in 172 caseswith CIN 2-3.The clinical effects of CKC and LEEP on the treatment of CIN 2-3 were compared and evaluated.Results：Compared with the CKC group，the LEEP group had shorter operation time，less average intraoperative blood loss，lower rate of postoperative bleeding and cervical adhesion，higher postoperative recurrent rate，and lower risk HPV clearance rate after operation（both P＜0.05）.Although the rate of residual disease after operation in CKC group was lower than that in the LEEP group，the difference was not statistically significant（P＞0.05）.Postoperative pathology showed the relapsed patients in the LEEP group were all CIN 3，80%samples ofmulti quadrant involvement，residual lesions accounted for 60%.Conclusion：LEEP was super selection to CKCwith fewer blood loss，shorter operation time，and fewer postoperative complications；but LEEP was inferior to CKC in reducing recurrent rate（especially in high grade lesion level，specimen with multiquadrant involvement），and persistenthigh-risk HPV infection.So CKC still couldn'tbe replaced completely by LEEP.

cervical intraepithelial neoplasia；cold knife conization；loop electrosurgical excision procedure

Am iloride protects PC12 cells from MPP＋induced injury via autophagy-lysosome pathway

ZHANG Run-ping，LIJian-ping
（Department of Neurology，Suzhou New District People′s Hospital，Suzhou Jiangsu 215129，China）

R713.42

A

1671－7783（2014）04－0355－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140130

王宁宁（1973—），女，湖北枣阳人，副主任医师，主要从事妇科肿瘤的研究。

2014－05－22 ［编辑］刘星星

［中图分类号］R971

A［文章编号］1671－7783（2014）04－0359－04

［作者简介］张润娉（1986—），女，河南罗山人，医师，主要从事老年神经内科疾病研究。