IL-33／TLR4信号通路在A549细胞上皮 间质转化中的作用

刘超，郑金旭，许姣，朱勤，杜传冲

（江苏大学附属医院呼吸科，江苏镇江212001）

IL-33／TLR4信号通路在A549细胞上皮 间质转化中的作用

刘超，郑金旭，许姣，朱勤，杜传冲

（江苏大学附属医院呼吸科，江苏镇江212001）

目的：探讨IL-33／TLR4信号通路在上皮来源的A549细胞上皮间质转化中的作用。方法：培养A549细胞，用5 ng／mL的转化生长因子β1（TGF-β1）刺激A549细胞；在不同时间点（0，12，24，48 h）MTT法检测TGF-β1对A549细胞增殖的影响；荧光定量PCR方法检测IL-33信号通路中关键因子IL-33，Toll样受体4（TLR4）基因的表达改变；蛋白质印迹法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E钙黏蛋白（E-cad）、磷酸化蛋白激酶（p-AKT）的动态表达。结果：TGF-β1刺激A549细胞后，细胞增殖无明显变化（P＞0.05），IL-33表达量先升高，后下降（P＜0.05）；E-钙黏蛋白表达量逐渐下降，α-SMA表达量逐渐升高，TLR4先升高后下降（P＜0.05）；p-AKT表达量逐渐升高（P＜0.05）。结论：IL-33／TLR4信号通路在A549细胞的上皮 间质转化中发挥了重要作用。

白细胞介素-33；上皮间充质转化；Toll样受体4

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是弥漫性间质性肺疾病的常见类型，病因未明，呈慢性、进行性进展，发病率、致死率均较高，是特发性间质性肺疾病中最常见、最严重的一种疾病，平均生存期2～5年，死亡率超过大多数肿瘤，尚无特效药物治疗［1］。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肺纤维化发病的一种重要机制，肺泡上皮细胞受各种致病因素的刺激，获得间质细胞的表型，是成纤维细胞及肌成纤维细胞的重要来源［2］。前期研究已初步证明IL-33／ST2通路在肺纤维化疾病中异常激活［3－4］，作为与ST2受体同一超家族的Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4），与ST2有着极其相似的结构，是否也在肺纤维化的发病机制中发挥作用？本实验旨在通过转化生长因子β1（TGF-β1）诱导Ⅱ型肺泡上皮来源的A549细胞EMT过程，制备细胞层面的肺纤维化模型，探讨IL-33／TLR4信号通路与肺纤维化之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

TGF-β1（Perotech公司）；DMSO（Calbiochem公司）；DMEM高糖培养基、胎牛血清（Wisent公司）；PCR试剂盒及逆转录试剂盒（TaKaRa公司）；Trizol试剂（Invitrogen公司）；兔抗人E钙黏蛋白（E-cad）抗体、小鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（均购自武汉博士德公司）；兔抗人磷酸化蛋白激酶（p-AKT）抗体（CST公司）；兔抗人GAPDH抗体（Santa公司）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、兔抗小鼠IgG（Santa公司）；A549细胞购自上海中国科学院细胞库。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养A549细胞，将其接种于培养瓶中，放置在37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。

1.2.2 实验分组 将A549细胞接种于6孔板中，当细胞生长融合至70%～80%时，用无血清培养基饥饿12 h，换新鲜培养基，随机分组，于细胞培养液中加入TGF-β1，浓度为5 ng／mL［5］。

1.2.3 MTT比色法检测细胞增殖率 将培养的A549细胞用0.25%的胰酶消化，加入含10%胎牛血清的培养基，调整为2×104／mL的单细胞悬液后，传代到96孔板，每孔200μL，每组设3个复孔，并设调零孔。加入终浓度为5 ng／mL的TGF-β1处理12，24，48 h，每组取出一块培养板，每孔加入5 mg／mLMTT 20μL，继续培养4 h后弃上清，加入150μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。以630 nm波长为参考，在酶标仪上490 nm波长处测定各孔光密度值。重复上述实验过程3次。

1.2.4 PCR检测TLR4、IL-33基因的表达 用5 ng／mL的TGF-β1刺激细胞，测定不同时间点（0，12，24，48 h）细胞TLR4、IL-33 mRNA相对表达量。将细胞密度为1×105／mL的单细胞悬液接种到6孔板中，每孔加1 mL Trizol，按照其说明书提取细胞总RNA。取收集的RNA用TaKaRa逆转录试剂盒逆转录成cDNA。所用引物由上海捷瑞工程有限公司合成。引物序列如下，TLR4上游：5′-AGACCTGTCCCT GAACCCTATGAAC-3′，下游：5′-CTAAACCAGCCAGA CCTTGAATACA-3′；IL-33上游：5′-ATGCCAACAACA AGGAACACTCTG-3′，下游：5′-ATAAACACTCCAGGA TCAGTCTTGC-3′；β-肌动蛋白上游：5′-CCAGGCGTT ATGGTAGGCA-3′，下游：5′-TTCCATATCGTCCCAGTT GGT-3′。

TLR4扩增条件：95℃预变性30 s，1个循环；95℃变性。58℃退火30 s，72℃延伸20 s，40个循环。IL-33扩增条件：95℃预变性30 s，1个循环；95℃变性5 s，58℃退火20 s，72℃延伸15 s，40个循环。内参照β-肌动蛋白扩增条件：95℃预变性30 s，1个循环；95℃变性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸15 s，40个循环。结果用2－ΔΔCT法分析。

1.2.5 蛋白质印迹法测定E-cad、α-SMA、p-AKT的蛋白表达 用5 ng／mL的TGF-β1刺激细胞，测定不同时间点（0，12，24，48 h）细胞蛋白表达量的变化。将1×105／mL密度的单细胞悬液接种到6孔板中，每孔2 mL，加入TGF-β1后分别培养0，12，24，48 h，PBS冲洗3次后分别加入100μL含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的细胞裂解液，放置冰上，用细胞刮刮下细胞后收集到EP管中，5 min振荡1次，每次1 min，共4次，使细胞充分裂解；12 000 r／min离心15 min后吸取上清加入新的EP管中，4∶1加入5×上样缓冲液煮沸5 min，冷却至室温后，置于－20℃储存备用。蛋白上样后恒压电泳，电转至PVDF膜，时间为90 min，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，孵一抗（1∶1 000）过夜。TBST洗膜3次后，敷HRP标记的二抗（1∶5 000）30 min，再以TBST洗膜3次，于Typhoon扫描仪中成像并记录，重复上述实验3次，分析实验结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TGF-β1对A549细胞增殖的影响

A549细胞在高糖DMEM培养基中能生长，且细胞数量随时间的延长而增多。加5 ng／mL的TGF-β1培养12，24，48 h后，细胞增殖率分别为0.033 767，0.029 733，0.031 333，各时间点比较差无统计学意义（F＝0.252，P＞0.05）。

2.2 TGF-β1对A549细胞表面标志蛋白的影响

见图1、表1。随着刺激时间的延长，与对照组相比较，12，24，48 h的E-钙黏蛋白表达量逐渐下降（F＝29.332，P＜0.05）；与对照组比较，12，24，48 h的α-SMA表达量逐渐升高（F＝22.279，P＜0.05）。

图1 TGF-β1对A549细胞E-钙黏蛋白和α-SMA蛋白表达的影响

表1 TGF-β刺激后A549细胞E-钙黏蛋白1和α-SMA相对表达

2.3 TGF-β1刺激后A549细胞IL-33基因的表达

TGF-β1刺激A549细胞后IL-33基因呈现先升高后下降趋势（F＝37.412，P＜0.05）。12、24 h的IL-33基因表达量均明显高于对照组（P＜0.05），24 h时表达量达到最高，48 h表达量下降但仍然高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 TGF-β1刺激后A549细胞IL-33基因表达的变化

2.4 TGF-β1刺激后A549细胞TLR4基因的表达

TGF-β1刺激A549细胞后，TLR4呈先升高后下降趋势（F＝31.239，P＜0.05）。与对照组相比，差异有统计学意义。12、24 h的TLR4基因的表达量均明显高于对照组（P＜0.05），在24 h时表达量达到最高，48 h表达量下降但仍高于对照组，但差异无统计学意义。见图3。

图3 TGF-β1刺激后A549细胞TLR4基因表达的变化

2.5 TGF-β1刺激后A549细胞p-AKT蛋白的表达

TGF-β1刺激A549细胞后，0，12，24，48 h时p-AKT蛋白相对灰度值为0.073±0.037，0.149± 0.136，0.423±0.119，0.683±0.361，p-AKT蛋白表达水平呈逐渐升高的趋势（F＝30.737，P＜0.05）。12，24，48 h时p-AKT蛋白表达均明显高于对照组，见图4。

图4 TGF-β1刺激后A549细胞p-AKT蛋白的表达

3 讨论

肌成纤维细胞是IPF的重要效应细胞［6］，而上皮细胞的EMT过程是肌成纤维细胞的一个重要来源［7］。A549细胞为肺腺癌细胞，属上皮来源细胞，具备稳定的肺泡上皮细胞的特征，常被用作肺泡II型细胞的代表实验细胞。本实验结果显示，TGF-β1刺激A549细胞后，上皮细胞标志物E-钙黏表达量逐渐下降，而间充质细胞表型标志物α-SMA的表达量呈上升趋势，提示TGF-β1可以诱导A549细胞发生EMT，与本课题组前期研究结果一致［8］。进一步提示，EMT在IPF的发病中发挥重要作用，但EMT的具体机制仍未明确。

Schmitz等［9］在2005年通过测量工具发现IL-33同IL-1和成纤维生长因子具有相同的β三叶草结构，其基因序列、结构与IL-1和IL-18相似，属于IL-1超家族，在上皮细胞和内皮细胞表达较高，当上述细胞因各种因素受损伤时，IL-33可被动地释放出来，引起其他细胞的迁移、分化、成熟等生物学效应。本实验中，IL-33在TGF-β1刺激A549细胞12 h后开始增多，24 h达到最高峰，提示在TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化的早期，存在IL-33的高表达。我们推测，TGF-β1所致的A549细胞损伤释放了损伤相关分子IL-33。IL-33前体为31 000的蛋白，成熟的IL-33是经Caspase-1剪切后产生，分泌出细胞后，作为细胞因子通过IL-1受体家族发挥生物学作用［10］，如ST2等。TLR4也是IL-1受体家族成员之一，与ST2有相似的STI结构，故推测IL-33能够与TLR4结合而发挥生物学效应。Kurowska-Stolarska等［10］于2009年曾报道过IL-33刺激人巨噬细胞后，TLR2、TLR4表达升高，Liu等［11］也报道了在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中TLR2、TLR4的表达升高。本实验结果显示经TGF-β1处理过的A549细胞，TLR4 mRNA表达量升高，且趋势与IL-33的升高趋势相同，推断IL-33可通过TLR4发挥生物学作用。

激活的TLR4能够活化下游分子髓样分化因子88（MyD88），活化的MyD88能够募集肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）等，激活经典的TLR4／MyD88信号通路，启动NF-κB通路和MAPK通路，进而调节细胞的增殖、凋亡等生物学行为［12］。

Lombardo等［13］发现，TLR4还能够激活PI3K。PI3K激活后，其催化产物与AKT分子中PH结构域结合，使AKT磷酸化，PI3K／AKT通路被激活。p-AKT是AKT的活化形式，可间接反应PI3K的活性［14］。PI3K／AKT信号通路主要作用是抗凋亡。AKT还能通过对NF-κB和p53的间接作用影响细胞存活［14］。AKT通过磷酸化活化为p-AKT，然后激活kB激酶（IKK）导致NF-κB的抑制剂IκB的降解，从而使NF-κB从细胞质中释放出来进行核转位，激活其靶基因而促进细胞的存活。本实验中，p-AKT表达量随时间的延长逐渐增多，证明PI3K／AKT信号通路被激活。

综上所述，TGF-β1刺激后A549细胞出现损伤，而在损伤早期IL-33可能作为警报素从细胞中释放出来，启动一系列的抗损伤和抗凋亡反应。ST2和TLR4都可作为IL-33的受体，呈竞争关系。活化后的TLR4激活MyD88，逐渐激活下游分子，呈级连反应，最终导致纤维化的形成。然而，细胞信号通路错综复杂，本实验以TGF-β1诱导A549细胞的EMT，揭示了IL-33在EMT过程发挥了作用，为IPF的发病机制的阐述及治疗提供了部分新的思路。

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Effect of IL-33／TLR4 signal pathway in inducing A549 cells transition to mesenchymal cells from epithelium in vitro

LIU Chao，ZHENG Jin-xu，XU Jiao，ZHU Qin，DU Chuan-chong
（Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To investigate the role andmechanism of IL-33 in the process of turning epithelium-mesenchyme for A549 cellswhich is in one strain of human alveolar epithelial cells.M ethods：To stimulate cultured A549 cellswith TGF-β1（5 ng／mL）.MTT assay was used to assess the proliferation of the A549 cells in response to TGF-β1treatment the dynamic expressions of IL-33／TLR4 mRNA were detected by RT-PCR.Western blotting were employed to examine the mRNA and protein expressions ofα-smooth muscle actin（α-SMA）and E-cad，p-AKT.Results：The data showed that TGF-β1had no obvious effects on the proliferation of A549 cells.Stimulated by TGF-β1，E-cad expression of A549 cells gradually declined.α-SMA expression was higher.p-AKT expression gradually increased.Real-time PCR had shown that expressions of IL-33／TLR4 mRNA increased firstly then decreased gradually.The significant differenceswere observed from 0 h to 24 h，especially on 24 h，compared with control group（P＜0.05）.Conclusion：IL-33／TLR4／PI3K／AKT signal transduction pathway promoted epithelial-mesenchymal transition（EMT）of A549，especially on earlier inflammatory reaction.

IL-33；epithelial-mesenchymal transition；Toll like receptor

R332；R563

A

1671－7783（2014）04－0283－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140076

卫生部科研项目（WKJ2006－2－026）；上海市自然科学基金资助项目（10ZR1422600）

刘超（1987—），男，硕士研究生；郑金旭（通讯作者），教授，主任医师，博士生导师，E-mail：jxzh135＠163.com

2014－03－24 ［编辑］何承志