上皮细胞黏附分子和黏蛋白mRNA检测在良性和恶性胸腔积液鉴别诊断中的临床价值

孙伟，李坚，陈园园

（1.江苏大学附属医院呼吸科，江苏镇江212001；2.江苏大学基础医学研究所，江苏镇江212013）

上皮细胞黏附分子和黏蛋白mRNA检测在良性和恶性胸腔积液鉴别诊断中的临床价值

孙伟1，李坚1，陈园园2

（1.江苏大学附属医院呼吸科，江苏镇江212001；2.江苏大学基础医学研究所，江苏镇江212013）

目的：评价上皮细胞黏附分子（epithelial celladhesionmolecule，EpCAM）mRNA和黏蛋白1（mucin 1）mRNA表达水平在良性和恶性胸腔积液鉴别诊断中的临床价值。方法：应用实时荧光定量PCR检测51例原发于非小细胞肺癌的恶性胸腔积液患者和22例结核性胸膜炎患者胸腔积液标本中的EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA的表达水平。构建受试者工作特征（ROC）曲线图。计算这两个肿瘤标志物独立或联合测定诊断恶性胸腔积液的敏感性和特异性。结果：恶性胸腔积液患者胸腔积液标本中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA的表达水平均明显高于结核性胸膜炎患者（P＝0.000）。根据ROC曲线取EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA水平的上限值，分别为14.64和11.82；结果显示，EpCAM mRNA诊断恶性胸腔积液的敏感性和特异性分别为84.3%和90.9%，黏蛋白1 mRNA诊断恶性胸腔积液的敏感性和特异性分别为86.3%和86.4%。采用串行试验联合评价EpCAM mRNA与黏蛋白1 mRNA测定诊断恶性胸腔积液的敏感度和特异性分别为80.4%和95.5%；以平行试验联合评价EpCAM mRNA与黏蛋白1 mRNA测定的敏感性和特异性分别为90.2%和81.8%。结论：EpCAM mRNA与黏蛋白1 mRNA对良性和恶性胸腔积液的鉴别诊断具有较高的临床应用价值，联合检测胸腔积液中EpCAM mRNA与黏蛋白1 mRNA可进一步提高对恶性胸腔积液的诊断效率。

上皮细胞黏附分子；黏蛋白1；恶性胸腔积液；结核性胸膜炎；诊断

胸腔积液是由多种疾病导致胸膜腔液体渗出增多或者回吸收减少引起的常见临床综合征。不同疾病导致的胸腔积液治疗方法和预后截然不同，故病因的诊断，尤其是良性和恶性胸腔积液的鉴别诊断极为重要。恶性胸腔积液的诊断确定主要依靠胸腔积液细胞学检查和胸膜活检的病理组织学检查；其中，胸腔积液脱落细胞检查是诊断恶性胸腔积液的金标准，阳性率为50%～60%［1］，但敏感性较低，容易漏诊，诊断结果不确定。因此，对很多具有潜在诊断价值的肿瘤标志物的研究增多，但得到的结果差异较大［2－5］，其原因有多方面，如肿瘤组织学类型不同致细胞学判断的难易程度存在差异、不同研究者使用的实验室检测方法不同、胸腔积液标本中肿瘤标志物定义折点方法不同等［6］。与其他肿瘤标志物相比，癌胚抗原诊断恶性胸腔积液具有较高的准确性［1，7］，但在良恶性胸腔积液鉴别诊断中仍有不同程度假阳性结果，降低了临床应用价值［3－4］。

CA19-9是诊断消化道恶性肿瘤的标志物，主要用于胰腺和胆道系统的恶性肿瘤的诊断。廖君群［8］研究表明，CA19-9在恶性胸腔积液组中表达水平明显高于良性积液组，对鉴别诊断有一定的参考价值，但敏感性较低，仅44.9%，对临床上高度疑似恶性胸腔积液者漏诊概率增大。因此，探寻新的具有高敏感性和特异性的肿瘤标志物来诊断恶性胸腔积液很有必要。

本研究采用实时荧光定量PCR分别检测51例原发于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的胸腔积液患者和22例结核性胸膜炎患者胸腔积液标本中上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）mRNA和黏蛋白1（mucin 1）mRNA的表达水平，评价其在恶性胸腔积液诊断中的临床意义。

1 对象与方法

1.1 病例

选择2012年10月至2013年10月在江苏大学附属医院住院的由NSCLC引起的恶性胸腔积液患者51例，其中男30例，女21例，年龄47～84岁，平均65岁。所有患者的原发肿瘤均经病理组织学检查确诊，胸腔积液的恶性性质由脱落细胞学检查或胸膜活检病理组织学检查确定。NSCLC的组织学类型包括鳞癌35例，腺癌16例。

另选择同期住院的22例结核性胸膜炎患者作为良性胸腔积液对照组，其中，男12例，女10例，年龄50～78岁，平均62岁。所有结核性胸膜炎患者均符合以下诊断标准中任何一项：痰或胸腔积液抗酸杆菌阳性；胸膜活检有结核的病理组织学证据；胸腔积液腺苷脱氨酶＞28 U／L，临床抗结核治疗有效。为保证实验结果的稳定性，同时选取14名健康受试者的血标本作为实验mRNA对照（样本mRNA校对值），其中，男7例，女7例，年龄55～70岁，平均60岁。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 人淋巴细胞分离液购自天津市灏扬生物制品科技有限责任公司，反转录试剂购自美国Fermentas公司，荧光定量PCR试剂购自日本Toyobo公司，CFX96型荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2.2 标本处理 所有入组人员均抽取胸腔积液200 mL，EDTA抗凝，1 h内分离淋巴细胞。细胞总RNA的提取严格按照Trizol试剂操作步骤进行，应用分光光度计测定RNA的D（260 nm）／D（280 nm）值。严格按反转录试剂盒说明操作进行反转录反应。

1.2.3 引物设计 引物序列全长选自Pubmed基因库，引物序列由上海生物工程有限公司设计及合成，经基因库核实。EpCAM、黏蛋白1及内参β-肌动蛋白的引物和PCR扩增产物长度见表1。

1.2.4 荧光定量PCR反应 每份胸腔积液标本均扩增β-肌动蛋白及EpCAM和黏蛋白1。每个反应终体积20μL，其中，反转录混合物2μL，DEPC处理水7μL，上下游引物各0.5μL，PCR混合物10 μL。PCR扩增参数：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环后制作 熔解曲线。

表1 引物设计

1.2.5 结果分析 测定EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA在胸腔积液中表达的Ct值，用2－△△Ct表示相对表达量，构建受试者工作特征（ROC）曲线图。根据ROC曲线分析结果确定在诊断恶性胸腔积液时获得最大敏感性和特异性的EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA阈值（上限值），分别为14.64和11.82，高于该阈值为阳性。

1.3 统计学处理

应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。mRNA的表达量呈非正态分布，故两组间的比较采用Mann-Whitney U检验。两组间阳性率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA在良恶性胸腔积液中的表达

恶性胸腔积液组患者EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA的表达水平均明显高于结核性胸膜炎患者（P＝0.000）。以14.64和11.82分别作为胸腔积液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA阈值时，恶性胸腔积液患者胸腔积液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA的阳性率分别为84.3%和86.3%，良性肺疾病患者阳性率分别为9.1%和13.6%。两组比较差异均有统计学意义（P＝0.000），见表2。

表2 两组患者胸腔积液中EpCAM m RNA和黏蛋白1 m RNA水平和阳性率的比较

2.2 ROC曲线对胸腔积液标本EpCAM mRNA诊断效率的判断

EpCAM mRNA ROC曲线下面积为0.874（标准误为0.044），取14.64为其表达量上限时，敏感性为84.3%，特异性为90.9%。见图1。

2.3 ROC曲线对胸腔积液标本黏蛋白1 mRNA诊断效率的判断

黏蛋白1 mRNA ROC曲线下面积为0.830（标准误为0.060），取11.82为其表达量上限时，敏感性为86.3%，特异性为86.4%。见图2。

2.4 两个肿瘤标志物对恶性胸腔积液的诊断价值

以ROC曲线确定的两个肿瘤标志物上限值为阳性时，EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA诊断恶性胸腔积液的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，见表3。当联合胸腔积液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA检测结果分析时，如果以其中1项指标阳性作为对恶性胸腔积液的诊断依据 （平行试验），则敏感性为90.2%，特异性为81.8%；若以2项指标均阳性作为对恶性胸腔积液的诊断依据（串行试验），敏感性为80.4%，但特异性上升至95.5%。

图1 胸腔积液EpCAM m RNA的ROC曲线图

图2 胸腔积液黏蛋白1 m RNA的ROC曲线图

3 讨论

EpCAM又称TACSTD1，属于黏附分子家族，是由肿瘤相关基因编码的一个跨膜蛋白，几乎表达于所有的正常上皮中，且大都处于细胞间紧密连接处，但在鳞状上皮中无表达。EpCAM在不同细胞中表达差别很大，在上皮来源的肿瘤细胞中呈高表达，而在结缔组织及造血系统来源的细胞、脑组织和血管内皮细胞中则缺乏表达［9］。研究显示，EpCAM过表达的肿瘤细胞增殖活性高，侵袭性强，而其表达下调可明显抑制肿瘤细胞的增殖活性及侵袭性［10］。Zhang等［11］根据RT-PCR对60例胸、腹腔渗出液脱落细胞EpCAM mRNA检测后发现，其对恶性渗出液诊断的敏感性、准确性分别为75.0%和81.6%，而细胞学检查只有55.6%和67.3%。由此看出，EpCAM mRNA对良性和恶性渗出液鉴别有一定临床价值，故EpCAM mRNA的检测可作为细胞学检查的辅助手段用于恶性渗出液的临床诊断。

表3 EpCAM mRNA和黏蛋白1 m RNA对良恶性胸腔积液的鉴别诊断意义

黏蛋白是一种高分子量糖蛋白，在机体各种黏膜表面呈大量分布，迄今已发现有16种黏蛋白（MUC1～MUC16）。在黏蛋白家族中，黏蛋白1是一种Ⅰ型跨膜蛋白，占有重要地位。黏蛋白1造成肺癌的侵袭与转移的机制是抑制肿瘤细胞的细胞细胞、细胞-基质间的黏附作用，致肿瘤细胞间黏附力减弱，进而细胞脱离，发生侵袭与转移［12］。黏蛋白1对肿瘤细胞的黏附作用具有双向调节功能，正常情况下，黏蛋白1主要在乳腺、胰腺、消化系统、呼吸系统、生殖系统等多种组织、器官中的导管上皮细胞或腺腔面表达。研究发现，黏蛋白1在肿瘤细胞表面呈高表达，表达量为正常细胞的10倍以上，且与肿瘤的恶性程度呈正相关［13］。国内研究证明，NSCLC组织中黏蛋白1 mRNA的阳性表达率与患者的预后呈负相关［14］。由于黏蛋白1具有肿瘤特异性表达的特点，最近有研究表明，胸腔积液中黏蛋白1 mRNA的表达在肺癌患者癌转移的检测中具有重要价值，可为临床治疗和预后评估提供重要的参考依据［15］。

本研究结果显示，NSCLC患者恶性胸腔积液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA表达水平明显高于结核性胸膜炎患者。胸腔积液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA ROC曲线下面积结果说明，胸腔积液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA浓度越高，胸腔积液恶性的可能性越大。本研究中单个指标比较结果显示，胸腔积液中EpCAM mRNA的诊断效率优于黏蛋白1 mRNA，虽然单独检测EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA对恶性胸腔积液的诊断有一定的价值，但尚有一定局限性；通过对EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA组合分析显示，两者联合检测不但敏感性提高，而且特异性还保持较高水平，表明两者联合检测可互为补充，提高诊断的准确性。

综上所述，我们的研究初步表明，继发于NSCLC患者恶性胸腔积液中EpCAM mRNA和黏蛋白1 mRNA的表达水平明显高于结核性胸膜炎患者，检测胸腔积液中二者的表达水平对于良性和恶性胸腔积液的鉴别诊断具有一定的临床应用价值。

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Diagnostic value of pleural fluid EpCAM m RNA and MUC1 m RNA in differentiating benign from malignant pleural effusion

SUNWei1，LI Jian1，CHEN Yuan-yuan2
（1.Department of Pulmonary Medicine，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Institute of Basal Medicine Science，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To evaluate the diagnostic value of epithelial cell adhesion molecule（EpCAM）mRNA and mucin 1（MUC1）mRNA expression levels in the pleural fluids for differentiating benign from malignant pleural effusion.M ethods：Quantitative real-time PCR was used to detect the expression levels of EpCAM mRNA and MUC1 mRNA in pleural effusion samples from 51 patientswith malignant pleural effusion caused by non-small cell lung cancer and 22 patients with tuberculous pleurisy.Receiver operative characteristic（ROC）curveswere constructed to assess diagnostic performance.The sensitivity，specificity and accuracy of individual or combined detections of EpCAM mRNA and MUC1 mRNA in the diagnosis of malignant pleural effusion were calculated.Results：The levels of pleural fluid EpCAM mRNA and MUC1 mRNA in patientswithmalignant pleural effusion were significantly higher than those in patientswith tuberculous pleurisy（P＝0.000）.According to the ROC curve analysis，cut-off values for EpCAM mRNA and MUC1 mRNA in pleural fluid from benign pleural effusion were 14.64 and 11.82，respectively.The sensitivity and specificity of EpCAM mRNA formalignant pleural effusion diagnosis were 84.3%and 90.9%，respectively.The detection of pleural fluid MUC1 mRNA achieved sensitivity of 86.3%and specificity of 86.4%，respectively.When combined EpCAM mRNA and MUC1 mRNA with a serial test，the sensitivityand specificitywere80.4%and 95.5%，respectively.Combination EpCAMmRNA and MUC1mRNA with a parallel test yielded the 90.2%sensitivity and 81.8%specificity，respectively.Conclusion：Pleural fluid EpCAM mRNA and MUC1mRNA were two useful tumormarkers in the diagnosis ofmalignant pleural effusion；combination of both two could improve diagnostic performance for distinguishing benign pleural effusion from malignant pleural effusion.

epithelial cell adhesionmolecule；mucin 1；malignant pleural effusion；uberculous pleurisy；diagnosis

R561.3

A

1671－7783（2014）04－0328－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140104

孙伟（1982—），男，硕士研究生；李坚（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：lijian54126＠163.com

2014－04－17 ［编辑］刘星星