UFLC-MS/MS法测定中毒患者血清中氨氯地平的浓度

目的：利用快速高效液相色谱-质谱联用仪（UFLC-MS/MS）建立血清中氨氯地平的快速定性定量分析方法，为临床中毒患者的快速诊治提供依据。方法：选用Shim-pack XR-ODS色谱柱，以乙腈10 mmol/L醋酸铵为流动相，采用梯度洗脱进行分离，流速：0.3 ml/min；柱温：40℃；进样量：10μl。样品用乙腈进行蛋白沉淀后进样，选用3200型质谱仪的多重反应监测（MRM）扫描方式进行检测。结果：氨氯地平的线性范围为0.078～500 ng/ml，定量下限和最低检测限分别为0.05 ng/ml和0.005 ng/ml。日内精密度为2.5%，日间精密度为3.1%。结论：本研究所建立的方法快速、灵敏，重复性好，适用于氨氯地平中毒患者血液标本的快速定性定量检测。

氨氯地平；高效液相色谱-串联质谱法；中毒

[Abstrractbjecttiive：To develop an method for the determination of the amlodipine in human serum by ultra fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UFLC-MS/MS）and provide proof for the poisoners′fast diagnosis.Meetthod：Amlodipine was extracted from serum by acetonitrile which was used as deproteinated solvent，and separated on a Shim-pack XR-ODS column maintained at 40℃with acetonitrile and 10 mmol/L ammonium acetate as mobile phase by gradient elution.The flow rate was 0.30 mL/min-and 10μL aliquot of residues were injected.Detection was carried out by multiple reaction monitoring on a 3200 MRM system.Ressullttss：The assay was linear over the range 0.078-500 ng/mL with a limit of quantitation of 0.05ng/mL and a limit of detection of 0.005ng/mL.The relative deviation of intra-and inter-day were 3.1%and 2.5%.Conclussiion：The method was rapid，sensitive and reliable for the determination of amlodipine in human blood serum.The assay was applied to a fast qualitative and quantitative determination of amlodipine poisoners.

氨氯地平（Amlodipine），分子式：C20H25CLN2O5，分子量：408.1，化学结构式如下。

氨氯地平是一种1，4－二氢吡啶类的长效降压药，其终末消除半衰期约为35～50 h，7～8天后血药浓度可达稳态。因其具有服药剂量低、药效维持时间长等特点，目前已成为临床一线用药。因此，血液中氨氯地平浓度的测定显得尤为重要。血清中氨氯地平浓度的测定主要采用液相色谱-串联质谱法，酶联吸附免疫分析法等方法[1-2]。本实验利用快速高效液相色谱-质谱联用仪（UFLC-MS/MS）建立了一种检测血清氨氯地平的方法，为临床急慢性中毒患者的快速诊断和抢救提供了科学依据。

1 材料和方法

1.1 主要仪器与试剂3200型液相色谱-串联质谱仪（美国Applied Biosystem公司产品）：配有电喷雾离子化源（ESI）以及Analyst 1.5数据处理软件；UFLC快速高效液相色谱系统（日本岛津公司产品）：包括二元输液泵、自动进样器、切换阀和柱温箱；GL-88B振荡器：江苏海门医疗器械厂。氨氯地平对照品由中国标准物质中心提供；乙腈、乙酸铵均为色谱纯；其他试剂均为分析纯；实验用水为经0.22μm水膜滤过的重蒸水。空白血清由解放军第307医院血库提供；中毒患者血液标本由北京市各医院急诊科提供，4 ml全血，不加抗凝剂。

1.2 溶液的配制 储备液的配制：精密称取1 mg氨氯地平对照品，置于100 ml容量瓶中，加入乙腈溶解，稀释至刻度，配制成10μg/ml的储备液。标准系列溶液的配制：取氨氯地平储备液适量，用65%乙腈稀释至0.08、0.31、2.50、5.00、10.00、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 ng/ml待用。

1.3 色谱条件 色谱柱：Shim-pack XR-ODS色谱柱（长度100 mm，直径3 mm，膜厚0.25μm）。流动相：乙腈10 mmol/L醋酸铵梯度洗脱，梯度条件是时间为0.1、8.0、9.0、16.0 min，乙腈浓度分别为10%、95%、95%、10%。流速：0.30 ml/min；柱温：40℃；进样量：10μl。

1.4 质谱条件 离子源：离子喷雾离子化源，正离子方式检测；离子喷射电压（IS）：5500V；温度：550℃；源内气体（1Gas1）压力：60psi；气体（2Gas2）压力：65 psi；气帘气体（CUR）压力：30 psi；扫描方式为多重反应监测（MRM）；用于定量分析的离子反应分别为选择m/z409.1→m/z238.0（DP电压：27 eV；CE电压：16 eV）和m/z409.1→m/z294.0（DP电压：27 V；CE电压：14 eV）

1.5 样品的提取及净化 取全血4 ml，离心取上层血清用0.1 mol/L NaOH调至pH=9。取血清0.5 ml加乙腈1 ml，振荡器混匀1 min。离心分离上清液，0.25μm滤器过滤至进样瓶待测。

2 结果

2.1 优化方式 取氨氯地平储备液，用65%乙腈配制稀释至1000 ng/L，采用针泵进样模式，进行母离子、碎片离子分析，选择4对离子反应定性，分别为m/z409.1→m/z238.0、m/z409.1→m/z294.0、m/z409.1→m/z377.2、m/z409.1→m/z320.3。优化离子源参数及各对DP、CE电压参数，相应的母离子扫描图，见图1；二级全扫描质谱图，见图2；氨氯地平标准液的保留时间为8.97 min，见图3。

2.2 线性范围 取空白血清，加入标准系列溶液配制成对照品血清，血清经处理后，进样10 ml进行UFLC-MS/MS分析。每个浓度5个样本，连续测量3天。以待测物峰面积（X）对浓度（Y，ng/ml）绘制标准曲线，得线性方程为Y=0.0027X-1.4598，r=0.9999。

图1 氨氯地平母离子扫描图

图2 氨氯地平二级全扫描质量图

图3 UFLC-MS/MS测定人全血中氨氯地平的典型色谱图

2.3 检出限 选择m/z409.1→m/z238.0（DP电压：27eV；CE电压：16eV）和m/z409.1→m/z294.0（DP电压：27 V；CE电压：14 eV）为定量分析的离子反应，信噪比（S/N）取30:1，标准液最低检出限可达到0.005 ng/ml。

2.4 回收率及精密度测定 取0.1、10.0、500.0 ng/ml对照品血清，用乙腈提取。每浓度5样本，连续测定3天。根据当日的工作曲线，计算样品的测得浓度，进行回收率及精密度测定分析。三个浓度的平均回收率依次为109.7%、100.8%、99.6%。日内精密度为2.5%，日间精密度为3.1%。

3 讨论

在实践工作中，氨氯地平中毒患者主要以自杀为目的主动服用者居多；其次是长期服用或未严格依照医嘱服用而造成的氨氯地平蓄积性中毒。氨氯地平中毒患者轻者多伴有头晕、恶心、呕吐等胃肠道症状，严重者会导致昏迷。因此，还要与胃肠道疾病和脑病进行鉴别诊断。本方法采用的梯度洗脱条件，在保证灵敏度的前提下，能检出大多数临床常见药品毒物，为临床快速救治提供参考。据本实验室检测记录统计，2008年至2012年间，氨氯地平中毒检测出46例。临床上，氨氯地平的治疗量应小于2 ng/ml。儿童的中毒剂量应该更低。氨氯地平因其分子量大，血液透析不易清除，一般采用血液灌流或血液置换[3]。

氨氯地平血液含量很低，以往的检测方法多采用高效液相色谱法，并不能满足临床需求。因氨氯地平见光易分解，整个实验操作应尽量避光[4]。本实验采用UFLC-MS/MS方法快速定量血清含量，选用MRM模式定量氨氯地平药物浓度，选用较有特异性且丰度相对较高的4对反应离子，减少了非目标化合物的干扰，具有选择性好，灵敏度高，分析时间短，重复性好等特点。应用此方法也可检测尿液中氨氯地平的浓度，有利于临床观察不同治疗方法的效果。

利用所建方法检测了15例疑似氨氯地平急、慢性中毒患者的血清标本。结果10例中毒患者血清中检测到氨氯地平，浓度范围为0.5～280 ng/ml。病例1：女，76岁。不明原因昏迷入院，初期血压降低不明显，6 h急送筛查镇静安眠类药物及降血压类药物，血清氨氯地平浓度为280.0 ng/ml，30 h后复测降至165 ng/ml，血液灌流治疗后54 h降至74 ng/ml， 7天后血清中检测不到氨氯地平。患者血清检测全扫描图，见图4，与氨氯地平标准物质保留时间一致。病例2：男，51岁，长期服用氨氯地平6个月后送检血液，利用本方法检测血清氨氯地平浓度为6.9 ng/ml。病例3：女，2岁，误服氨氯地平4 mg，3 h送检，血清氨氯地平浓度为1.8 ng/ml。

图4 氨氯地平中毒患者血清全扫描色谱图

本方法针对中毒患者血清标本，采用乙腈提取，操作简单。利用气相色谱-质谱联用仪检测，建立了一种快速检测氨氯地平的方法，为氨氯地平急慢性中毒患者的快速诊断和抢救提供了科学依据。

[1]Hotha KK，Roychowdhury S，Mullangi R，et al.Rapid quantification of amlodipine enantiomers in human plasma by LC-MS/MS：application to a clinical pharmacokinetic study[J].Biomed Chromatogr，2013，27（9）：1192-1199.

[2]王 燕，李鹏飞，马 萍，等.LC-MS/MS法测定人血浆中氨氯地平的浓度[J].质谱学报，2012，33（3）：181-185.

[3]梁 超，程晓华，张 红，等.LC-MS法评价两种苯磺酸氨氯地平片的人体生物等效性[J].第二军医大学学报，2007，28（3）：299-301.

[4]李金凤.血液净化治疗氨氯地平过量中毒一例报告[J].临床合理用药杂志，2012，5（6c）：161-162.

（收稿：2014-03-03修回：2014-03-14编校：齐 彤）

UFLC-MS/MS法测定中毒患者血清中氨氯地平的浓度

李嘉琳，邱泽武，孙爱丽，孙成文

UFLC-MS/MS determination of amlodipine in poisoned human blood serum

LI Jia-lin，QIU Ze-wu，SUN Ai-li，SUN Cheng-wen.Poisoning treatment center,PLA 307 Hospital,Beijing 100071,China
Corresponding author：SUN Cheng-wen，E-mail：suncw163@163.com

amlodipine；UFLC-MS/MS；poison

R 994.3；O 657.7

A

2095-3496（2014）02-0087-03

100071北京，解放军第307医院全军中毒救治中心（李嘉琳，邱泽武，孙爱丽，孙成文）

孙成文，E-mail：suncw163@163.com