固定化乳酸脱氢酶的催化性质研究

柳畅先，宁 静，俸红梅

(中南民族大学 化学与材料科学学院，武汉 430074)

固定化酶是用适当方法将酶固定于一定空间内，在保持自身特性时又能再回收和重复使用的酶制品.20世纪70年代以来对固定化酶的研究非常活跃[1]，其领域多为应用基础、工业生产等[2-6].壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基产物，分子链中存在大量的氨基和羟基，可通过改性和交联，使其具有更多的功能[7-10].本文以壳聚糖为载体，戊二醛作为交联剂，对乳酸脱氢酶(LDH)固定化，研究酶催化动力学性质，探讨将其用于酶法测定的条件.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

水浴恒温振荡器(SHA-C型,江苏医疗仪器厂)，紫外可见分光光度计(752型,上海光谱仪器有限公司)，精密pH计(PHS-3C型,上海雷磁仪器厂)，分析天平(FA-2004型,上海精科天平)，超级恒温水浴槽(CS-501型,武汉实验仪器厂)，集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S型,河南省予华仪器有限公司)，增力电动搅拌机(JJ-1型,江苏金坛科兴仪器厂)，循环真空泵(SHZ-D型,上海东玺制冷仪器设备有限公司)，电动离心机(XYJ81-1型,金坛市恒丰仪器厂).

壳聚糖(国药集团化学试剂有限公司)，戊二醛25%水溶液(国药集团化学试剂有限公司)，液体石蜡(国药集团化学试剂有限公司)，span80(国药集团化学试剂有限公司), 石油醚(国药集团化学试剂有限公司)，丙酮(天津天大化学试剂厂)，冰乙酸(武汉中南化工试剂有限公司)，NaOH (湖北化工科技开发公司)，氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，上海伯奥生物科技有限公司)，水合肼(天津科密欧化学试剂有限公司)，LDH(美国sigma公司)，乳酸标准溶液(9.41mol/L).

1.2 实验方法

1.2.1 固定化酶的制备

称取1.2 g壳聚糖，加入40 mL 5%冰醋酸搅拌溶解，倒入加有160 mL液体石蜡和6 mL span80的三颈烧瓶中，25℃搅拌30 min后，加入20 mL 6%戊二醛，40℃搅拌1 h.用NaOH溶液调节pH为10～11，70℃搅拌2 h.用石油醚和丙酮多次洗涤并抽滤，得固定化酶载体.

取1g载体于装有20 mL 0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.0)的锥形瓶中，加入酶液，振荡2.5h，用水反复洗涤并抽滤，得固定化LDH[11].

2.2.2 酶活力的测定

于比色皿中加入3 mL 0.05mol/L Tris-HCl-水合肼缓冲溶液(pH=9.2)，40μL 0.1mol/L NAD溶液，80μL 9.41mol/L乳酸标准溶液，10 μL LDH溶液，快速混匀后测定340nm处吸光度变化值，计算游离酶活力.

于离心管中加入5 mL 0.05mol/L Tris-HCl-水合肼缓冲溶液(pH=10.2)，50 mg固定化LDH，200 μL 0.1mol/L NAD溶液，100 μL 9.41mol/L乳酸标准溶液后快速混匀，反应3 min，在340nm处测定上清液的吸光度变化值，计算固定化酶活力.

v=ΔA×V/(Δt×ε×b)，式中v为酶活力(酶促反应速度，μmol/min或U)，ΔA为吸光度变化值，V为反应液体积(mL)，Δt为时间变化值(min)，ε为摩尔吸光系数(L/mmol·cm)，b为光程(cm).ρ=v/m，式中，ρ为酶固载量(U/g)，v为酶活力(U)，m为固定化酶质量(g).相对酶活力=(酶活力/酶活力最大值)×100%.

2 结果与讨论

2.1 固定化条件

戊二醛体积分数、pH值、偶联时间对酶固定化的影响结果见图1.由图1a可见，在一定范围内酶固载量随戊二醛体积分数的增加而增大，戊二醛体积分数为0.53%时酶固载量达到最大值，继续增加后酶固载量则下降，是由于过量的戊二醛自身会发生缩合反应附着在载体表面使酶不易被固定.由图1b可见，在不同pH值的Tris-HCl缓冲溶液中制备固定化酶，酶固载量随着溶液pH的增大而增加，pH达到7.0时酶固载量最大，继续提高pH值则酶固载量逐渐减小.由图1c可见，酶固载量也随着酶的偶联时间延长而增加，在2.5 h达到最大值后下降，偶联时间长有利于酶分子与载体接触，但偶联的酶太多时，会使载体孔径变小，底物不容易与酶结合，使酶固载量反而降低.

φ/% pH t/h a) 戊二醛体积分数；b) pH值；c) 偶联时间图1 戊二醛体积分数、pH值、偶联时间对酶固定化的影响Fig.1 Effect of volume proportion of glutaraldehyde,pH value and binding time on the immbilization of enzyme

2.2 酶学性质

2.2.1 温度和pH对酶活力的影响

温度和pH对酶活力的影响结果见图2.由图2a可见，将游离酶和固定化酶置于不同的温度下，酶活力随温度的升高而增大，达到各自的峰值之后则下降，游离酶和固定化酶的最适温度分别为51℃和50℃.由图2b可见，在不同pH值的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液中测定酶活力，游离酶和固定化酶的最适pH值分别为9.2和10.2.酶固定化以后其最适pH值发生偏移的原因可能是部分氨基酸侧链和酶分子的静电荷改变，或者载体的理化性质受到影响，固定化酶内外扩散层的氢离子浓度产生差异，致使pH值变化.

θ/℃ pH1) 游离酶；2) 固定化酶a) 温度；b) pH图2 温度和pH对酶活力的影响Fig.2 Effect of temperature and pH on the enzymatic activity

2.2.2 米氏常数和酶的活力稳定性

以乳酸为底物，分别在游离酶和固定化酶的最适条件下测定酶活力，绘制Lineweaver-Burk曲线，结果见图3.米氏常数(Km)在数值上等于酶促反应达到其最大速度一半时的底物浓度，可表示酶和底物之间的亲和力，Km值越大则亲和力越弱.图3中游离酶和固定化酶的Km分别为16.2 mmol/L和0.7 mmol/L，酶固定化以后，由于酶蛋白结构和载体电荷的影响，使Km值改变，而Km的减小有利于其进行酶促反应.

1) 游离酶；2) 固定化酶 图3 Lineweaver-Burk曲线Fig.3 Lineweaver-Burk curves

将游离酶和固定化酶置于30℃水浴中，每隔30 min测定其活力，结果见图4. 由图4可见，随着时间的延长，酶活力会逐渐降低，游离酶的活力下降很快，180 min后活力降为最初的50.6%，相比之下固定化酶的活力下降较慢，180 min后其活力为最初的82.8%固定化酶有更好的活力稳定性，是因为酶与载体分子之间的作用力的增加使得酶分子刚性增强，抵抗变性的能力提高.

1) 游离酶；2) 固定化酶图4 酶的活力稳定性Fig.4 The active stability of enzymes

2.2.3 酶的贮存稳定性和固定化酶的复用性

酶的贮存稳定性和固定化酶的复用性结果分别见图5和图6.图5中将游离酶和固定化酶贮存在4℃，每隔7d测定酶活力，35 d后游离酶和固定化酶活力分别为最初的26.9%和81.3%，表明固定化酶具有更好的贮存稳定性.图6中将固定化酶在室温下与底物重复反应，连续使用6次后，酶活力仍保留60%以上，在用游离酶进行催化反应时只能使用1次，故相对于游离酶而言，固定化酶具有较大的优越性.

1) 游离酶；2) 固定化酶图5 酶的贮存稳定性Fig.5 The storage stability of enzymes

图6 固定化酶的复用性Fig.6 The reusability of immobilized enzyme

3 结论

LDH的最佳固定化条件为：偶联时间2.5 h, 戊二醛体积分数0.53%，溶液pH 7.0.游离酶和固定化酶的最适温度分别为51℃和50℃，最适pH分别为9.2和10.2，Km分别为16.2 mmol/L和0.7 mmol/L.在30℃存放3 h后，游离酶和固定化酶活力分别为最初的50.6 %和82.8 %；在4℃存放35 d后，游离酶和固定化酶活力分别为最初的26.9 %和81.3 %.固定化酶连续使用6次后，酶活力仍保留60%以上.说明固定化酶具有较好的活力稳定性、贮存稳定性以及复用性.

参 考 文 献

[1] Krajewska B. Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilizations: a review[J].Enzyme Microb Technol,2004,35(2):126-139.

[2] Zhou Q Z K,Chen X D. Immobilization of β-galactosidase on graphite surface by glutaraldehyde[J].J Food Eng,2001,48(1):69-74.

[3] Chen D H,Liao M H. Preparation and characterization of YADH-bound magnetic nanoparticles[J].J Mol Catal B:Enzym,2002,16(5):283-291.

[4] Bbtigeri S S,Neau S H. Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads[J]. Biomaterials,2002,23(17):3627-3636.

[5] Bhushan I,Parshad R,Qazi G N,et al.Lipase enzyme immobilizationon synthetic beaded macroporous copolymers for kinetic resolution of chiral drugs intermediates[J].Process Biochem,2008,43(4):321-330.

[6] Mayer J,Kranz B,Fischer L. Continuous production of lactulose by immobilized thermostable β-glycosidase from pyrococcus furiosus[J].J Biotechnol,2010,145(4):387-393.

[7] Schmidt T F,Caseli L,Santos Jr D S,et al. Enzyme activity of horseradish peroxidase immobilized in chitosan matrices in alternated layers[J].Mater Sci Eng:C,2009,29(6):1889-1892.

[8] Dincer A,Telefoncu A. Improving the stability of cellulase by immobilization on modified polyvinyl alcohol coated chitosan beads[J].J Mol Catal B:Enzym,2007,45(1/2):10-14.

[9] Gabrovska K,Georgieva A,Godjevargova T,et al. Poly(acrylonitrile) chitosan composite membranes for urease immobilization[J].J Biotechnol,2007,129(4):674-680.

[10] Cetinus S A,Sahin E,Saraydin D. Preparation of Cu(II) adsorbed chitosan beads for catalase immobilization[J].Food Chem,2009,114(3):962-969.

[11] 覃建军,刘 璇,柳畅先.壳聚糖固定化乳酸脱氢酶的制备及酶学性质研究[J].分析科学学报,2009,25(5):571-574.