苦物质引起去甲肾上腺素预收缩的大鼠主动脉平滑肌舒张的作用机理研究

刘庆华, 赛文博，于孟飞，谈 丽

(中南民族大学 生命科学学院 湖北省武陵山区资源植物种质改良与利用重点实验室，武汉 430074)

味觉是哺乳动物的重要感觉之一，而苦味则是人类六种基本味觉中呈味阈值最低的一种. 味觉是人类自我保护的一种重要机制. 因为大部分对人体有毒有害的物质多呈苦味，对苦味的呈递和抗拒成为了人类避免毒素侵害的第一道防线[1].

现已知TAS2R受体是负责苦味感知的主要受体，在人体和小鼠中分别有25种和36种亚型，它们不仅分布在味蕾上，还在肠道、大脑、呼吸道、血管等诸多部位均有不同程度的表达[2]，这使苦物质舒张血管、气管的研究成为近期的热点.大量研究结果表明：苦味剂如氯喹(Chloroquine)和苦精(Denatonium)等能显著影响平滑肌的舒张与收缩[3, 4],苦味剂能舒张由毒蕈碱受体激动剂引起的气道肌肉收缩，其作用途径是通过TAS2R - Gβγ蛋白-PLCβ- IP3- IP3R途径增加细胞内Ca2+浓度并激活BKs ，最终导致细胞膜去极化而使细胞松弛[5, 6]；但另有研究报道典型苦味剂氯喹还可完全抑制BKs[7].故苦物质的作用机理仍然需要深入研究.

在经典理论途径中，平滑肌的收缩与细胞胞质内钙浓度的升高密切相关，故苦物质可能通过抑制胞内Ca2+浓度的升高而实现平滑肌的舒张.本文以肌肉张力换能系统为主要工具，以氯喹和苦精为苦物质的代表，研究了苦物质氯喹在血管平滑肌上的收缩/舒张作用，其内皮组织、组织内部和外部Ca2+在其中所起的作用，并结合多种通道阻断剂探讨其作用通路.通过研究苦物质引起血管收缩/舒张的分子机制，为呼吸道和心血管疾病的预防和治疗提供了理论支持.

1 材料

1.1 试剂和仪器

去甲肾上腺素(Norepinephrine, 远大医药中国有限公司, 国药准字H42021301), 氯喹(Chloroquine)、苦精(Denatonium)、ROCK的抑制剂(Y27632)、2-氨基乙氧基二苯基硼酸(2-APB)、茜素紫(Gallein)、硝苯地平(Nifedipine) (美国 Sigma).

生理盐溶液(2 Ca2+PSS): NaCl 135 mM, KCl 5 mM, CaCl22 mM, Glucose 10 mM, HEPES 10 mM, MgCl2·6H2O 1mM.无Ca2+PSS (0 Ca2+PSS): NaCl 135 mM, KCl 5 mM, EGTA 0.5 mM, Glucose 10 mM, HEPES 10 mM, MgCl2·6H2O 1 mM.Ca2+母液: CaCl2120 mM.

BL-420S张力换能器、恒温水浴系统(成都泰盟科技有限公司), PH计(PHS-2F型, 上海精科), 细胞培养箱(INE600型, 德国MEMMERT), 无菌操作台(BSC11B2-1404型, 苏洁净化).

1.2 实验动物

SPF级Wistar雄性大鼠，8～10周龄，150～210 g，购自湖北省疾病预防控制中心.在控温、控湿的条件下，自由饮水进食.动物实验和处理均遵照《中南民族大学实验动物使用与福利指导手册》.

2 方法

2.1 大鼠的处死和胸主动脉的分离

大鼠饲养48 h后短颈处死，将口腔和四肢钉在解剖板上，腹部喷洒75%的酒精后剪开并向颈部解剖，沿胸腔至颈部结缔组织为止.胸腔剪开后，用镊子小心拨开心肺组织，可见大鼠胸主动脉处于脊椎上方，取胸腔内的主动脉约3 cm立即放入事先置于冰上的PSS溶液中待用.

2.2 胸主动脉的处理及标本上样

将组织转至解剖镜下，两端固定，使用维纳斯剪小心除去外周的结缔组织和内腔中的残留血液，用棉线反复轻柔擦拭血管内壁3次以去除内皮.处理完成后，将动脉剪成长约6 mm的片段后与挂钩连接，小心衔接张力换能器后置于内有6 mL PSS并持续通氧的37℃的恒温水浴槽中.前负荷调至300 mg，开始平衡.平衡期间，每15 min换液1次，共换液4次.平衡完毕后使用80 mM高钾溶液进行预刺激，充分刺激组织活性后换液洗脱，至恢复至基线.5 min后即可开始试验.

2.3 G蛋白抑制剂共孵育胸主动脉

将2.1中的血管环用灭菌的PSS洗2遍后，转至装有DMEM的48孔板中，随即封盖后放入细胞培养箱中培养6～8 h.对照组使用DMEM培养基即可，实验组需加入相应浓度的PTX和Gallein对G蛋白的各个亚基进行阻断.

3 结果

3.1 去甲肾上腺素对于大鼠胸主动脉的收缩作用

去甲肾上腺素对于大鼠胸主动脉的收缩作用结果见图1.由图1a可见，去甲肾上腺素(NE)介导的大鼠胸主动脉血管环(rTAVR)的收缩作用呈剂量依赖效应.在10 μM时达到最大收缩，当剂量增大至100 μM时对组织的收缩作用不升反降.由图1b可见，当NE的作用浓度达到1μM时，胸主动脉已经基本达到最大收缩且该浓度不会对组织产生毒害作用.故后续试验中以1μM为刺激浓度.

a) NE对rTAVR收缩作用的量效曲线；b) NE对大rTAVR收缩作用的统计图图1 NE引起大鼠胸主动脉血管环收缩效应Fig.1 The constrict effect of NE on rat thoracic aorta

3.2 苦物质对于NE引起rTAVR收缩的舒张作用

苦物质对于NE引起rTAVR收缩的舒张作用结果见图2.由图2a和2b可见，Chloroquine和Denatonium两种药物均可舒张由NE引起的rTAVR收缩，且这种舒张作用呈剂量依赖效应. 由图2c和2d可知，当药物浓度达到2～4 mM时，两种苦物质均可完全舒张由NE引起的rTAVR收缩.当药物浓度达到4 mM时，Chloroquine和Denatonium舒张比例分别为(99.74±0.26)%和 (100.00±0.00)% (n=7). 故以Chloroquine和Denatonium为代表的苦物质对大鼠胸主动脉平滑肌具有高效而迅速的舒张作用.

a,c) Chloroquine ; b,d) Denatonium图2 氯喹和苦精对大鼠胸主动脉环的舒张作用 Fig.2 The relaxant effect of Chloroquine and Denatonium on rat thoracic aorta

3.3 内皮细胞对于Chloroquine引起的舒张作用的影响

血管内皮细胞具有强大的内分泌功能，包括自分泌和旁分泌，它们可产生内皮源的收缩和舒张物质，如一氧化氮超极化舒张因子和内皮素等[8].为了阐明血管内皮细胞在Chloroquine介导的NE预收缩的血管平滑肌的舒张过程中的作用，实验先使用NE对rTAVR进行预收缩，再使用乙酰胆碱(Ach)对内皮完整的血管环产生舒张作用证明内皮是否被去除[9]，结果见图3.由图3可见，内皮完整组和去内皮组的血管环的收缩都均被3mM Chloroquine完全地舒张，其舒张比例分别为(99.89±0.1)% 和(99.97±0.03)% (n=3,p>0.05).故Chloroquine对血管的舒张作用不依赖内皮组织介导的，它与内皮源性的舒张因子无关，提示Chloroquine是直接作用于血管平滑肌而导致血管舒张.

a) 内皮去除组; b) 内皮完整组 图3 内皮组织在氯喹起的大鼠胸主动脉环舒张作用中的影响Fig.3 The effect of endothelium on Cloroquine-induced relaxation in rat thoracic aorta

3.4 Chloroquine对NE介导的胞内钙升高的抑制作用

经典的平滑肌收缩理论认为平滑肌收缩同平滑肌细胞浆内的钙浓度密切相关.胞浆内钙浓度升高主要通过细胞外Ca2+经由细胞膜上的电控或配体型离子通道，如L型钙通道等进入胞浆，或者由IP3引起肌质网存储的细胞内钙释放继而导致胞浆钙浓度升高.本实验通过研究Chloroquine对NE引起的内钙浓度升高的两条途径的阻断作用阐明苦物质引起血管舒张的信号通路，结果见图4.由图4a可知，在3 mM Chloroquine预处理20 min后，NE在0 mM Ca2+PSS和2 mM Ca2+PSS溶液中均不能引起收缩.由图4b可知，0 mM Ca2+条件下，NE可引起内钙释放而引起平滑肌细胞的小幅度收缩.随后，“恢复”平滑肌组织外液Ca2+浓度至正常2 mM，肌张力显著升高.在血管平滑肌收缩达到平台期后，3 mM Chloroquine可完全舒张NE引起的收缩.以上结果有力地证明了NE可同时阻断平滑肌细胞内钙释放和外钙流入而引起预收缩的血管平滑肌发生舒张，提示Chloroquine可能通过阻断IP3受体介导的内质网钙库的释放而引起血管舒张.

a,b) Chloroquine阻断NE引起的rTAVR收缩作用;c,d) NE引起rTAVR收缩作用及Chloroquine对其的舒张作用图4 Chloroquine对平滑肌细胞内钙释放和外钙流入通路的阻断Fig.4 The inhibitory effect of Chloroquine of the release of intracellular calcium stores and extracellular influx

3.5 Chloroquine作用通路的研究

为阐明Chloroquine除阻断内钙释放和外钙流入之外的引起血管平滑肌舒张的其他信号通路，本实验通过使用各种离子通道阻断剂(Y27632、Gallein、Gd3+、2-APB、Nifedipine)阻断不同的信号通路来研究Chloroquine舒张血管平滑肌的机制.Y27632为RhoA通路阻断剂， RhoA-2ROK通路可介导钙敏感性降低引起的血管平滑肌收缩，这种收缩是钙非依赖性的，它主要通过磷酸化作用抑制肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的活性来增加肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化水平，从而增强平滑肌的收缩力[10].Gallein为G蛋白β和γ亚基的阻断剂，苦味的呈递是由G蛋白介导的，故可通过阻断G蛋白的β和γ亚基探明Chloroquine的阻断作用是否直接作用于G蛋白[11].Gd3+为三价阳离子，可阻断一系列三价和三价以下阳离子通道，统称非选择性阳离子通道(NSCC)[12]，其中包括Ca2+、Na+、K+等.2-APB是TRPC通道的阻滞剂，TRPC通道为氯离子通道的一种，它与膜受体激活、Ca2+储存释放、细胞膜脂质和运输等多种细胞活动相关[13].Nifedipine为L型钙通道特异性阻滞剂，L型钙通道是一种电压依赖性钙通道的类型钙通道，是介导外钙进入胞浆的最主要途径之一，故也是影响血管平滑肌收缩和舒张的重要途径之一.

在37℃，充分通氧条件的水浴槽内使用以上多种阻断剂对平衡后的rTAVR预处理20 min后(Gallein在细胞培养箱中预处理6～8 h)，使用1μM NE进行收缩，待收缩稳定后再使用3 mM Chloroquine对血管环进行舒张.图5a为NE引起收缩的统计图，图5b为Chloroquine舒张比例的统计图.从图5可见， Y27632预处理的血管环在收缩上与对照组并无差异(p>0.05,n=5)，对Chloroquine的收缩并未起到任何阻断作用，故Chloroquine并未通过RhoA舒张NE预收缩的血管平滑肌. Gallein(n=4)、NSCC (n=3) 和TRPC (n=3) 通路也未在这种舒张作用中发挥作用.但Nifedipine可以显著舒张NE预收缩的血管平滑肌(p=0.025<0.05,n=4).说明L型钙通道很可能是NE引起血管环收缩的外钙进入细胞途径之一，结合图3a中Chloroquine对NE的完全阻断作用可知，L型钙通道的阻断是Chloroquine舒张血管平滑肌过程中一条重要原因.

a) 各种通道阻断剂对于NE引起rTAVR收缩的阻断作用；b) 各种通道阻断剂对于ChloroquinerTAVR舒张的阻断作用图5 Chloroquine引起预收缩的血管平滑肌舒张的机理Fig.5 The mechanism of Chloroquine-induced relaxation in precontracted thoracic aortic smooth muscle

4 讨论

本文首次发现了以Chloroquine和Denatonium为代表的苦物质对于NE介导的rTAVR的收缩具有快速、高效的舒张作用，初步探讨了苦物质Chloroquine舒张大鼠胸主动脉平滑肌的作用机理，结果表明：(1)Chloroquine可阻断NE引起的动脉平滑肌肌质网钙库的释放；(2)Chloroquine引起的舒张作用与内皮细胞介导的血管平滑肌舒张和RhoA通路相关的钙敏感机制无关；(3)Chloroquine可阻断L型钙通道，这也是引起血管平滑肌舒张的主要作用之一，即Chloroquine可同时阻断平滑肌细胞外钙流入和内钙释放这两条信号通路来调节肌肉的收缩与舒张.

本文还探讨了其他与平滑肌内钙升高有关信号通路在苦物质引起的肌肉舒张过程中的作用，但并未验证出除L型钙通道阻断以外的其他通路，推测 Chloroquine可能作用于钙调蛋白或其他靶分子从而影响肌球蛋白轻链的磷酸化作用，造成平滑肌舒张，而且这种舒张作用与离子通道的关闭或开放无关；或者苦物质可能直接作用于肌球蛋白轻链，直接抑制其去磷酸化位点，强制舒张平滑肌；可能由于Chloroquine作用于钠钙交换体或钠泵等蛋白，从而降低胞浆内的钙浓度，造成舒张[8].这些问题仍有待深入研究，为其成为高血压药物的研究奠定功能性基础.

参 考 文 献

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