水稻细胞核DNA含量和倍性的流式细胞术测定

覃永华，徐 鑫，王春台

(中南民族大学 生命科学学院 武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉 430074 )

流式细胞术(FCM)是应用流式细胞仪对处于液流中的各种荧光标记的微粒进行多参数快速准确定性、定量测定的方法，它可直接获取细胞核DNA含量，间接获取细胞的倍性[1-4].生物体的单倍体基因组所含DNA总量 (简称C值)是研究种群进化、物种分类、亲缘关系和生态学的有用分析工具和证据[5]，可通过测定C值来鉴定杂交物种[6].由于植物在生长发育和抵抗外界不良环境的过程中，会发生基因组拷贝数增加[7](多倍性)和基因组扩增[8](核内再复制)，故倍性鉴定可用于评估和分析组织细胞在不同生长环境下的细胞分裂活动.

目前，流式细胞术已广泛应用于植物和动物细胞核DNA含量和倍性的测定，但其在水稻中的应用仍不成熟，由于解离液与水稻材料不匹配使解离效果不好、碎片多、大细胞易破碎，准确性差.尽管已有解离液LB01和Otto成功提取水稻单一组织细胞核的实验报道[9,10]，但由于水稻不同部位组织结构存在显著差异，往往需要用不同解离液解离才能获得良好效果，因为水稻叶片表面有较厚的角质层，纤维含量较高，细胞内次生代谢物多，细胞核的悬液制备较困难[11].本文以3种其他物种中成功报道的分离缓冲液为参考，制备了水稻的细胞核悬液，通过比较以筛选出适用于水稻不同组织细胞核流式细胞术分析的最佳缓冲液，改善水稻细胞核分离效果，为快速、准确鉴定出水稻不同组织细胞核DNA含量和倍性提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

流式细胞仪(FACSCalibur, 美国Backman公司).以水稻(Oryzasativa. L)品种中花11为研究对象，取在MS培养基中正常生长2周的幼苗叶、根尖以及大田中授粉15 d后的种子为实验材料.

细胞核分离缓冲液缓冲液I (Tris-MgCl2buffer)：200 mM Tris，4 mM MgCl2·6H2O，0.5% (v/v) TritonX-100，pH 7.5.细胞核分离缓冲液II ( Lysis buffer，LB01)：15 mM Tris，2 mM Na2EDTA，0.5 mM 四盐酸精胺，80 mM KCl，20 mM NaCl，0.1%(v/v)TritonX-100，15 mMβ-巯基乙醇，pH7.0～8.0，-20 ℃下保存，用时解冻.细胞核分离缓冲液III (Otto buffer)︰Otto I含100 mM 柠檬酸，0.5%(v/v)Tween20，pH 2.0～3.0；OttoII含400 mM Na2HPO4·12H2O，pH 8.9.解离液的组成为V(Otto I)︰V(Otto II)= 2︰1，弃上清后加Otto I[9,10,12].

1.2 细胞核悬液制备

参考文献[13]，取1 g 正常生长2周的水稻苗幼叶，用蒸馏水洗净，滤纸吸干后放入预冷的培养皿里，加入预冷的解离液1 mL Otto buffer，用锋利刀片快速切碎，将材料浸没在解离液里.用400目的滤膜将浸有材料的解离液过滤到1.5 mL离心管中，置于4 ℃孵育5 min.在1000 r/min，4 ℃离心5 min.弃上清后，再加入200 μL预冷的解离液Otto I，同时加入10 μL预冷的染料1 μg/μL PI(使用浓度50 μg/mL)和1 μL的10 μg/μL RNase母液(使用浓度50 μg/mL)，每个样品共约 200 μL细胞核悬浮液.

1.3 流式细胞术分析测定

参考文献[14]，经PI染色的每个样品通过流式细胞仪测定20000个细胞核.利用CellQuest ProTM软件获取数据，并通过ModFit LT软件显示直方图(横坐标以DNA相对含量，纵坐标为细胞核个数)，计算G0/1峰的变异系数[CV(%) = 标准差/平均值×100].根据未知样本和标准样本图中峰值的相对位置，确定未知样本的染色体倍性.一般CV值小于3%～5%，表示结果准确.

2 结果

2.1 不同缓冲液的效果比较

不同缓冲液获得的水稻幼叶细胞核相对DNA含量结果见图1.由图1可见，使用这3种缓冲液制备的水稻幼叶细胞核悬浮液，经流式细胞仪分析测定均可产生非常明显的峰，但图1a中，在2C的主峰的左侧出现明显的干扰峰，同时收集到完整的细胞核相对较少.图1b结果较图1a好，除未见杂峰外，完整细胞核的收集也相对要多.图1c结果最好，未见杂峰，主峰出现了2C和4C两峰，并且能收集到大量的完整细胞核.缓冲液I、II、III的CV值分别为9.02 %、6.13 %、4.57 %，CV值越小，峰图效果越好.

a) 缓冲液I；b) 缓冲液II；c) 缓冲液III图1 不同缓冲液获得的二周龄水稻苗幼叶细胞核相对DNA含量Fig.1 The relative DNA contents of cell nuclei isolated from young leaf of two weeks-old rice seedling by different buffer solutions

2.2 用Otto缓冲液对不同组织的鉴定效果

采用Otto buffer分离缓冲液制备水稻根尖和种子的细胞核悬浮液，基于流式细胞仪检测DNA峰值的位置可确定样品的倍性，结果见图2.由图2可见，根尖细胞的峰图2a中出现了较高的2C峰外，还出现了较低的4C峰，横坐标(DNA含量)也显示出4C是2C的两倍.峰图表明根尖特别是分生区细胞分裂旺盛，除了存在二倍体2C细胞外，还存在大量待分裂的四倍体4C细胞.图2b中种子的DNA含量检测显示了3个峰值，分别为2C、3C和4C，其中2C含量最高，4C最少；横坐标所显示的DNA含量和倍性水平是对应的.种子中除了含有大量已分裂的二倍体细胞2C和少量待分裂的四倍体4C细胞外，由于胚乳细胞是三倍体，所以其DNA含量为3C，其DNA值也正好介于2C和4C之间.以上结果说明Otto buffers可作为一种较好的缓冲液分离完整的细胞核.

a) 根尖；b) 种子图2 水稻根和种子细胞核相对DNA含量Fig.2 The relative DNA contents of cell nuclei isolatedfrom root and seed in rice

3 讨论

流式细胞术可用于DNA含量和倍性的检测，对研究植物进化、亲缘关系和细胞分裂活动具有重要的参考意义.常规的染色体计数法测定水稻倍性不仅对技术要求很高，而且由于水稻细胞核较小或染色体对数多，要得到准确的结果有很大难度.流式细胞术可很好地解决这一难题，但由于水稻组织细胞自身结构的特异性造成了很难选取合适的解离液用于水稻不同组织细胞核DNA含量和倍性的测定[4]，故制备一种合适的缓冲液用于流式细胞检测水稻细胞十分必要.

本文通过流式细胞技术比较了3种缓冲液制备水稻组织细胞核悬液的DNA的效果，结果表明：缓冲液III(Otto buffer)制备的细胞核悬液能成功地鉴定出水稻不同组织部位的倍性水平.同时，该缓冲液也可用于水稻根尖和种子的DNA含量和倍性的研究，为类似的研究提供了参考.但该缓冲液也存在着有不足之处，例如，在种子胚乳中应存在6C的细胞核，但是实验中未形成明显的波峰，可能是缓冲液对维持细胞核的完整性不够.不同植物的组织结构和化学成分存在较大差异，解离液与待测植物样本可能不匹配.当解离液不匹配待测植物时，非但不能保持细胞核完整，还会加速细胞核破碎.故对不同植物要选择不同的细胞核分离缓冲液，或改变缓冲液成分来维持细胞核的完整性以获得较高分辨率.

参 考 文 献

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