氧化石墨烯/Fe3O4复合材料固定辣根过氧化物酶催化去除酚类废水

唐和清,黄 佳,常 青

(中南民族大学 化学与材料科学学院，武汉430074)

辣根过氧化物酶(HRP)是以铁卟啉为辅基的血红素蛋白，在过氧化氢(H2O2)存在时能催化氧化酚类物质产生苯氧自由基，自由基相互聚合，形成可通过沉淀或过滤除去的不溶性聚合物[1,2]，故被广泛运用于酚类废水的去除.酚类化合物是一类原型质毒物，与细胞原浆中的蛋白质作用，使人和动物中毒[3].在煤炭转化、纺织、树脂和塑料加工、洗涤剂、炼油、钢铁、木材、肥皂、洗涤剂、燃料和其他有机化学品等工业领域中酚类物质被广泛运用[4].

HRP催化氧化酚类物质的作用机理第一步是H2O2和静态酶中的Fe(III)反应生成化合物I(HRPI)，HRPI是一个高氧化态的催化中间体，包含一个含氧Fe(IV)中心和一个带正电荷的卟啉.一分子还原性底物的加人，生成另一个含有含氧Fe(IV)中心的催化中间体HRPII.HRPI 和HRPII都是强氧化剂，氧化还原电势接近+1V.第二步也有一分子还原性底物参加，使HRPII还原成静态酶[5].在传统的含酚废水酶促处理中，大多使用的是溶液酶，易受废水中其他污染物的影响，稳定性差、易失活、不能继续使用.固定化酶不仅可解决酶的回收、再利用等问题，还提高酶的稳定性和酶对环境的适应能力，对于耐酸、耐碱、耐高温等耐极端条件酶的开发具有重要意义[6].

1 实验部分

1.1 样品、试剂和仪器

苯酚、2，4-二氧苯酚、七水硫酸亚铁、六水氯化铁、氨水、聚乙二醇、高锰酸钾、4-氨基安替比林(4-AAP)、铁氰化钾、EDC (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，HRP(R.Z≥3.1, 上海雪满生物科技有限公司).

高效液相色谱仪(HPLC U-3000型,Thermo Scientific公司)， 傅立叶红外光谱仪( Nicolet Nexus 470 型, Thermo Nicolet 公司)，振动样品磁强计(ADE 4HF, Dymek公司).

1.2 GO/Fe3O4复合材料的制备

由hummer法制备氧化石墨[7].量取30 mL已知浓度的氧化石墨超声30 min，称取0.466 g FeCl3·6H2O和0.48 g FeSO4·7H2O与之混合超声10 min.逐滴滴入20 mL 2.5 mol·L-1的氨水溶液中，60 ℃超声反应60 min，多次洗涤后，50 ℃真空干燥箱中烘干备用.

1.3 HRP的固定

在18 mL pH=6 的磷酸缓冲液中加入0.2 g GO/Fe3O4和2 mg HRP放入100 mL锥形瓶中，超声10 min后，加入EDC使其终浓度为2 mg·L-1，于150 r/min、30 ℃的摇床中反应11 h(见图1).反应完成后用缓冲液反复洗涤排除未固定化的酶的干扰，定容后保存.

图1 EDC将HRP固定在GO/Fe3O4上的示意图Fig.1 Schematic illustration of HRP immobilized on GO/Fe3O4 by EDC

1.4 酶活的测定

在反应器皿里加入100 μL的0.2 mol·L-1苯酚，100 μL的4.8 mol·L-1的4-AAP，200 μL 2.0 mmol·L-1H2O2，适量的pH为7.4磷酸缓冲溶液和酶溶液，终溶液体积为1.8 mL.在紫外可见分光光度计下检测其在505 nm处的吸光度[8].

1.5 酚类物质分析方法

用高效液相色谱(HPLC)测定分析酚类物质的浓度，检测条件为UV检测器，色谱柱为C-18 (规格5 μm, 150×4 mm).流动相是甲醇和水体积比例为60∶40，流速0.8 mL·min-1，在270 nm 和288 nm双波长检测.

1.6 酚类物质的去除

在100 mL的锥形瓶中加入固定化酶(酶活0.1 U)，酚类物质(1 mmol·L-1)，H2O2(1.5 mmol·L-1)，聚乙二醇(按照与酚类物质的质量比为0.4添加)，pH=6.4的磷酸缓冲溶液(25 mmol·L-1)，反应总体积40 mL，在25℃下反应3 h.

2 结果与讨论

2.1 材料的表征

GO/Fe3O4复合材料的磁化曲线为"S"型曲线，结果见图2.如图2所示，所测的矫顽力(1.17 Oe)和剩磁(73.06×10-3emu·g-1)几乎可忽略不计，证实为超顺磁材料.饱和磁化强度Ms是25.96 emu·g-1.纯的Fe3O4饱和磁化强度约为68.8 emu·g-1[9]，GO/Fe3O4中Fe3O4的质量所占比例约为37.7%.HRP固定在具有磁性的GO/Fe3O4复合材料，可利用磁场作用将固定化酶与反应溶液分离供下一次循环使用.

Appiled Field/(104 Oe)图2 GO/Fe3O4复合材料多的磁化曲线Fig.2 Magnetization curve of GO/Fe3O4

GO/Fe3O4、GO/Fe3O4-HRP 和纯的HRP的红外光谱图见图3.由图3可见，1586 cm-1处吸收峰是由于Fe3O4覆盖在GO表面而形成了-COO的缘故，Fe-O的伸缩振动峰在560 cm-1，与之前的报道相似[10].当酶固定后，1398 cm-1附近的-OH 的面内变型振动吸收峰基本消失(见图3b).与GO/Fe3O4复合材料的谱图相比，GO/Fe3O4-HRP在1102 cm-1处有一个新峰出现，纯的HRP的谱图中同样具有这一个峰，归属于C-N 的伸缩振动，故推断HRP成功地固载在GO/Fe3O4复合材料表面.

五四时期，除了本土的封建主义意识形态，附着于各种思潮的西方意识形态也涌入中国，如功利主义（实用主义）、无政府主义、基尔特社会主义、新村主义，等等，宣扬着各自对社会的见解和主张。在各种主义中，有的标榜赞成“共产主义”或“社会主义”，但其内容和实质却是伪社会主义或反马克思主义的，一时让人难辨真假，阻碍着马克思主义的科学社会主义的传播。马克思主义与一些反马克思主义的意识形态进行了较长时间的论战，比较著名的是与功利主义（实用主义）、基尔特社会主义、无政府主义的论争。

σ/cm-1a) GO/Fe3O4; b) GO/Fe3O4-HRP; c) 纯HRP图3 不同样品的红外光谱图Fig.3 Fourier transform infrared spectra of different samples

2.2 酚类的去除

2.2.1 单独的苯酚与2,4-二氯苯酚的去除

固定化酶去除苯酚和2,4-二氯苯酚废水结果见图4.如图4所示，苯酚与2,4-二氯苯酚的去除率约为46%和99%.2,4-二氯苯酚在反应开始10 min后就基本去除完成，随时间延长苯酚的去除率逐渐增加，直至120 min才基本保持不变.在反应过程中苯氧自由基攻击酶的活性位点使酶失活[11]，是由于生产的苯氧自由基对酶的毒性不同所致.

t/min1) 2,4-二氯苯酚; 2) 苯酚图4 固定化酶去除苯酚与2,4-二氯苯酚Fig.4 Removal of phenol and 2,4-dichlorophenol by immobilized enzyme

2.2.2 苯酚与2,4-二氯苯酚混合溶液的去除

在HRP的作用下，H2O2将酚氧化生成高活性的苯氧自由基等中间物种，它们从酶的活性中心扩散到溶液，与酚分子或其它苯氧自由基本身发生反应，生成了一系列的聚合物.将相对较难被HRP氧化去除的酚类与相对较容易去除的酚类混合，由于去除途径的增多会提高难以去除的酚类的去除效率[12].在实际酚类废水的处理中，因废水不只含有一种酚类物质，去除混合溶液更有实际意义.实验将固定化酶用于处理苯酚(0.5 mmol·L-1)与2,4-二氯苯酚(0.5 mmol·L-1)水溶液的混合物，结果见图5.如图5所示，2, 4-二氯苯酚的去除率还保持99%，而苯酚的去除率从之前的46%提高到93%，故2, 4-二氯苯酚与苯酚混合后能促进苯酚的去除.

t/min1) 2,4-二氯苯酚; 2) 苯酚图5 固定化酶去除苯酚与2,4-二氯苯酚的混合物Fig.5 Removal of mixed solution of phenol and 2,4-dichlorophenol by immobilized enzyme

2.2.3 理化性质对混合酚类去除的影响

配置不同pH值的磷酸缓冲溶液(25 mmol·L-1)，其他条件不变，考察pH对去除效率的影响，结果如图6a所示.图6a中，在pH值为5.4～6.4范围内，随pH值的增加去除率增加；在pH值为6.4～9.4范围内，去除率随pH值增加而减小.酶蛋白分子上有很多酸性、碱性氨基酸残基，随pH的变化处于不同的解离状态会直接影响与底物的结合或者影响酶的空间结构使酶失活，因此最适pH值为6.4.温度对去除率的影响结果见图6b. 图6b中，随着温度的升高，苯酚的去除率与2,4-对氯酚的去除率都逐渐下降，温度为60℃时苯酚与2,4-二氯苯酚的去除率分别只有29%和49%，因为酶的活性受温度影响很大，温度过高时会变性，经优化后以25℃为最佳反应温度.

pH θ/℃图6 pH与温度对去除率的影响Fig.6 The influence of pH and temperature on the removal rate

2.2.4 固定化酶的循环利用

固定化酶的回收利用是评价酶固定化方法的一个重要指标，实验将制备的固定化酶用于混合的苯酚与2,4-二氯苯酚的催化去除，重复4次，每次3h，反应完成后用水多次洗涤固定化酶以便下一次实验.Zhang 等[13]证实自由酶在酚类物质的催化去除反应体系中迅速失活. 固定化酶循环使用去除混合酚溶液结果见图7.由图7可见，固定化酶在多次长时间使用后活性仍然保持了原有活性的约50%，酶的固定显著增加了HRP在酚类物质催化去除中的应用价值，使固定酶在实际废水处理中的使用成为可能.

Cycles图7 固定化酶循环使用去除混合酚溶液的活性Fig.7 Reusability of the immobilized enzyme in mixed solution of phenols removals

3 结论

(1)采用原位反相共沉淀的方法制备了GO/Fe3O4复合材料，以EDC为交联剂运用共价交联的方法将HRP成功固定在GO/Fe3O4复合材料上.

(2)固定化酶用于去除单独的苯酚与2,4-二氯苯酚和两者的混合溶液，易于去除的2,4-二氯苯酚与苯酚混合后对苯酚的去除起到了促进作用，提高了苯酚的去除率.

(3)固定化酶重复用于苯酚与2,4-二氯苯酚混合溶液的去除， 4次循环后固定化酶的活性保留超过50%.

参 考 文 献

[1] Sumithran S, Sono M, Raner G M, et al. Single turnover studies of oxidative halophenol dehalogenation by horseradish peroxidase reveal a mechanism involving two consecutive one electron steps: toward a functional halophenol bioremediation catalyst[J]. J Inorg Biochem, 2012, 117: 316-321.

[2] Song H Y, Liu J Z, Xiong Y H, et al. Treatment of aqueous chlorophenol by phthalic anhydride-modified horseradish peroxidase[J]. J Mol Catal B-Enzym, 2003, 22(1/3): 37-44.

[3] Cooper V A, Nicell J A. Removal of phenols from a foundry wastewater using horseradish peroxidase[J]. Wat Res, 1996, 30(4): 954-964.

[4] Wevar Oller A L, Agostini E, Talano M A, et al. Over-expression of a basic peroxidase in transgenic tomato (Lycopersicon esculentum Mill. cv. Pera) hairy roots increases phytoremediation of phenol[J]. Plant Science, 2005, 169(6): 1102-1111.

[5] Veitch N C. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme phytochemistry [J]. Phytochemistry, 2004, 65(3): 249-259.

[6] Bornscheuer U T. Immobilzing enzymes: how to create more suitable biocatalysts[J]. Angew Chem Int Edit, 2003, 42(29): 3336-3337.

[7] Chen C M, Yang Q H, Yang Y G, et al. Self-assembled free-standing graphite oxide membrane[J]. Adv Mater, 2009, 21(29): 3007-3011.

[8] Nicell J A, Wright H. A model of peroxidase activity with inhibition by hydrogen peroxide[J]. Enzyme Microb Tech, 1997, 21(4): 302-310.

[9] Chang Q, Deng K J, Zhu L H, et al, Determination of hydrogen peroxide with the aid of peroxidase-like Fe3O4magnetic nanoparticles as the catalyst[J]. Microchim Acta, 2009, 165(3/4): 299-305.

[10] Bai L Z, Zhao D L, Xu Y, et al. Inductive heating property of graphene oxide-Fe3O4nanoparticles hybrid in an AC magnetic field for localized hyperthermia[J]. Mater Lett, 2012, 68(1):399-401.

[11] Huang Q, Huang Q G, Pinto R A, et al. Inactivation of horseradish peroxidase by phenoxyl radical attack[J]. J Am Chem Soc, 2005, 127(5): 1431-1437.

[12] Song H Y, Liu J Z, Xiong Y H, et al. Treatment of aqueous chlorophenol by phthalic anhydride-modified horseradish peroxidase[J]. J Mol Catal B-Enzym, 2003, 22(1/2): 37-44.

[13] Zhang G P, Nicell J A. Treatment of agueous pentachi-orophenoi by horseradish peroxidase and hydrogen[J]. Wat Res, 2000, 34(5): 1629-1637.