亚叶酸钠注射液的健康人体生物等效性研究

程春燕，李 珍*，张逸凡，孙沁莹，陆建萍

(1.第二军医大学长海医院药学部，上海 200433；2.中国科学院上海药物研究所药物代谢研究中心,上海 201203；3.第二军医大学长海医院呼吸科，上海 200433；4.第二军医大学长海医院消化内科，上海 200433)

亚叶酸(folinic acid)是叶酸还原型的甲酰化衍生物，系叶酸在体内的活化形式。亚叶酸在肿瘤化疗中可作为化学保护剂，降低化疗对患者的毒副作用，减轻患者的痛苦；还可以作为生物调节剂，增加抗肿瘤药物对肿瘤细胞的细胞毒性，提高疗效，延长患者的生存期。临床主要用于高剂量甲氨蝶呤等叶酸拮抗剂的解救，与氟尿嘧啶同时应用于治疗晚期胃癌、大肠癌[1-3]等。由于亚叶酸钙对温度和空气敏感，在高温和接触空气的条件下易降解，稳定性差，在水中的溶解度不高。因其含有钙离子，与氟尿嘧啶混合易产生沉淀；而亚叶酸钠比亚叶酸钙具有更好的溶解性和稳定性，它能与氟尿嘧啶通过同一个给药泵24 h给药，可更好地应用在临床，且不良反应较少，偶见发热、皮疹、荨麻疹或哮喘等过敏反应。本研究参照文献[4]，采用LC-MS/MS法测定无活性、非对映异构体6R-亚叶酸、生物活性物质左旋体6S-亚叶酸及其活性代谢产物5-甲基四氢叶酸的血浆浓度，以此判定亚叶酸钠注射液与亚叶酸钙注射液的生物等效性，为临床用药提供依据。

1 材料和方法

1.1 受试对象 20例男性健康受试者，年龄(21.20±1.11)岁，体重(65.00±5.33) kg，身高(174.65±4.58) cm，体重指数(21.31±1.51) kg/m2，试验前体格检查和实验室检查均未见异常，无药物与食物过敏史，无烟、酒嗜好或滥用毒品史，筛选前2周内未服用过可能影响本试验研究结果的药物，入选前3个月内未参加过其他药物临床试验且无献血史。试验方案经第二军医大学长海医院伦理委员会批准后实施，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 药品和试剂 受试制剂：亚叶酸钠注射液[批号20110603，2 ml∶100 mg(以亚叶酸计),江苏方强制药厂有限责任公司]；参比制剂：亚叶酸钙注射液[批号11031632，10 ml∶0.1 g(以亚叶酸计)，江苏恒瑞医药股份有限公司]。亚叶酸钙非对应异构体(批号100252-200703，纯度85.9%)和甲氨蝶呤(批号100138-200603，纯度99.6%)由中国食品药品检定研究院提供；L-5-甲基四氢叶酸钙(批号20110320，纯度97.0%，含水量17%，上海汇伦生命科技有限公司)；甲醇和三氟乙酸为色谱纯(美国Sigma公司)；乙酸铵为色谱纯(美国ROE公司)；二巯基乙醇和氨水为色谱纯(德国Fluka公司)； 乙酸为色谱纯(美国Tedia公司)； 维生素C(纯度≥99%， 美国Sigma公司)； 水由Millipore纯水仪制备。

1.3 试验设计和血样采集 20例男性健康受试者随机分成2组，每组10人。受试者在试验前至少48 h及试验全过程不得吸烟或饮用可乐、茶、酒等含咖啡因或乙醇的饮料，避免食用富含叶酸的食物。分两周期分别单次120 min静脉滴注受试制剂亚叶酸钠注射液200 mg/m2(以亚叶酸计)或参比制剂亚叶酸钙注射液200 mg/m2(以亚叶酸计)。经7 d的清洗期后，两组受试者交叉用药。分别在给药前(0)和给药后的0.5、1.0、1.5、2.0(给药结束)、2.25、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、12和24 h于肘静脉采血3 ml，肝素抗凝，离心(4 ℃、3500 r/min、离心半径7 cm)10 min。定量分离血浆1.0 ml，加入抗氧剂(含维生素C、柠檬酸三钠、二巯基乙醇、蒸馏水)25 μl，置-70 ℃冰箱冷冻避光保存，待测。血样采集及处理过程避光操作。

1.4 血药浓度测定方法

1.4.1 仪器 LC-20AD输液泵和SIL-HTA型自动进样器(日本岛津公司)；API 4000型三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源(ESI源)以及数据采集使用的Analyst 1.4.2软件(美国Applied Biosystem公司)。

1.4.2 色谱条件与质谱条件 参照文献[4]。

1.4.3 血浆样品的预处理 血浆样品在避光条件下自然解冻后，取200 μl，向其中分别加入40 μl含稳定剂的甲醇∶水(1∶1，v/v)和40 μl内标溶液(1.00 μg/ml甲氨蝶呤溶液)和400 μl含稳定剂的甲醇，涡旋混合1 min，室温放置5 min，离心5 min(1.1×104r/min, 离心半径6 cm)。移取600 μl上清液于30 ℃氮气流下吹约20 min，向残留液中加入400 μl pH 3.5的醋酸铵缓冲液，涡旋混合，上样至活化好的固相萃取小柱，加水1 ml淋洗，加甲醇(含稳定剂)1 ml进行洗脱。收集洗脱液于干净试管中，取洗脱液20.0 μl进行LC-MS/MS分析。

本试验所测得的血药浓度数据用非房室模型进行计算，cmax和tmax用实测值表示；AUClast(从零到最后可测浓度的血药浓度-时间曲线下面积)用梯形法计算，AUCinf(从零到无穷大时间内血药浓度-时间曲线下面积)=AUClast+ctn/λz,tn是最后一次可实测浓度的取样时间；ctn是末次可测定样本药物浓度；λz是对数血药浓度-时间曲线末端直线部分求得的末端消除速率常数，可用对数血药浓度-时间曲线末端直线部分的斜率求得；t1/2用公式t1/2=0.693/λz计算。

1.4.4 标准曲线和定量下限 取含稳定剂的人空白血浆配制成相当于6R-亚叶酸、6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸血浆浓度分别为0.050/0.050/0.025，0.150/0.150/0.075，0.400/0.400/0.200，1.50/1.50/0.750，4.00/4.00/2.00，10.0/10.0/5.00和20.0/20.0/10.0 μg/ml的样品，按1.4.3项下操作，每一浓度进行双样本分析，进样20.0 μl，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标(X)，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标(Y)，用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算。根据标准曲线，6R-亚叶酸的线性范围为0.050～20.0 μg/ml，6S-亚叶酸的线性范围为0.050～20.0 μg/ml，5-甲基四氢叶酸的线性范围为0.025～10.0 μg/ml。

取含稳定剂的人空白血浆配制成相当于6R-亚叶酸、6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸血浆浓度分别为0.050/0.050/0.025 μg/ml的样品，在方法确证时对该样品进行6样本分析，并根据当日标准曲线计算每一样本测得浓度。求得该浓度的6R-亚叶酸、6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸日内精密度(RSD)分别为2.9%、5.4%和6.9%，准确度(RE)分别为9.3%、6.9%和13.3%(n=6)。

1.4.5 精密度和准确度 取低、中、高3个浓度(6R-亚叶酸、6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸血浆浓度分别为0.150/0.150/0.075，1.50/1.50/0.750和16.0/16.0/8.00 μg/ml)的质控样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定3 d，根据当日的标准曲线，计算质控样品的测得浓度。LC-MS/MS法测得6R-亚叶酸在每一质控浓度水平的日内精密度(RSD)均<4.8%，日间精密度(RSD)均<10.7%，准确度为-1.1%～4.0%。6S-亚叶酸在每一质控浓度水平的日内精密度(RSD)均<6.3%，日间精密度(RSD)均<6.6%，准确度在-2.2%～0.1%。5-甲基四氢叶酸在每一质控浓度水平的日内精密度(RSD)均<5.3%，日间精密度(RSD)均<6.7%，准确度为-3.1%～7.0%。

1.4.6 稀释试验 本试验考察超出定量上限的血浆样品，经空白血浆稀释后的准确度。取稀释质控样品，用人空白血浆稀释至1/4后，按1.4.3项下操作，进行6样本分析，根据当日标准曲线计算每一样本测得浓度。6R-亚叶酸测得的精密度和准确度分别为6.4%和-2.0%；6S-亚叶酸测得的精密度和准确度分别为5.8%和-2.8%；5-甲基四氢叶酸测得的精密度和准确度分别为4.0%和-8.5%。该结果表明，血浆样品经空白血浆稀释到1/4后测定不影响测定结果的准确性。

1.4.7 稳定性考察 血浆样品处理后4 ℃避光放置12 h后，血浆样品4 ℃避光放置6 h后，血浆样品经历3次冷冻-解冻循环后，血浆样品-70 ℃放置34 d后稳定，6R-亚叶酸、6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸储备液4 ℃放置12 d后均稳定，RE分别为3.7%、3.0%和5.1%。

1.4.8 基质效应 6R-亚叶酸、6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸低浓度基质效应分别为89.4%、93.2%和97.2%；高浓度基质效应分别为102%、96.1%和105%，且RSD均分别<11.8%、13.7%和9.1%；内标基质效应为94.9%，RSD为4.7%。结果表明，在本试验选择的色谱和质谱条件下，可忽略基质效应的影响。

2 结 果

2.1 主要药动学参数 受试制剂和参比制剂各成分的平均血药浓度-时间曲线见图1，主要药动学参数见表1。

表1 健康受试者单剂量静脉滴注亚叶酸钠注射液与亚叶酸钙注射液200 mg/m2后的主要药动学参数

Table 1 Main pharmacokinetic parameters of healthy volunteers after a single injection of sodium folinate and calcium folinate 200 mg/m2

表1 健康受试者单剂量静脉滴注亚叶酸钠注射液与亚叶酸钙注射液200 mg/m2后的主要药动学参数

tmax(t/h)cmax(ρB/μg·ml-1)AUClast(A/μg·h·ml-1)AUCinf(A/μg·h·ml-1)t1/2(t/h)6R- 2．15±0．24919．7±2．21179±16．1215±25．99．34±1．99 2．15±0．34820．2±2．77176±20．8208±27．28．76±1．046S- 1．80±0．2886．08±1．1215．0±1．7615．6±1．881．50±0．583 1．85±0．2356．60±1．0715．6±1．6616．1±1．651．36±0．3585- 3．18±0．5632．43±0．43719．7±3．8820．9±4．105．81±0．682 3．30±0．4412．50±0．40920．3±3．9321．5±4．165．69±0．773

图1 健康受试者单次静脉滴注亚叶酸钠注射液(受试制剂)和亚叶酸钙注射液(参比制剂)200 mg/m2后6R-亚叶酸、6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸的平均血药浓度-时间曲线

2.2 生物等效性评价 分别将6R-亚叶酸、6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸的主要药动学参数(AUClast和cmax)对数转换后进行方差分析，采用90%置信区间法进行等效性评价。AUClast和cmax均拒绝生物不等效假设，受试制剂6R-亚叶酸、6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸AUClast的90%置信区间分别为参比制剂相应参数的98.14%～106.08%、 92.37%～100.41%和94.00%～100.36%，均在80%～125%范围内；cmax的90%置信区间分别为参比制剂相应参数的92.49%～102.97%、85.99%～97.94%和94.05%～100.42%，均在75%～133%范围内。tmax经非参数检验均无显著性差异(P>0.05)[5]，表明受试制剂与参比制剂生物等效。

2.3 临床观察 所有完成试验的健康受试者在给药前后进行的生命体征、血常规、尿常规、血生化、心电图等检查数据均在正常范围内或异常无临床意义。20例健康受试者中有1例出现发热(37.9 ℃)，症状持续1 d，程度为轻度，未经处置自行痊愈，经研究者判定与研究药物(受试制剂)可能无关,未发生严重不良事件。采用精确概率法比较了两组不良事件发生情况，无显著性差异(P>0.05)。

3 讨 论

本试验采用LC-MS/MS法测定健康人血浆中的6R-亚叶酸、6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸浓度。血浆样品经过固相萃取处理后， 采用ESI源， 利用MRM扫描方式进行定量分析，血浆中的内源性物质不干扰待测物和内标的测定，具有灵敏、快速、准确和可重现等特点[4]。

所有受试者在给药前后进行的各项检查数据均正常或异常无临床意义，说明单次给予试验药物亚叶酸钠注射液200 mg/m2安全，耐受性良好。

本研究所得6R-亚叶酸、6S-亚叶酸和5-甲基四氢叶酸的药动学参数方差分析和90%置信区间分析结果表明，健康男性受试者单次静脉滴注受试制剂亚叶酸钠注射液与参比制剂亚叶酸钙注射液具有生物等效性。

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