愈骨疗伤方醇提物和水提物的药效学研究

陈海飞，鲍蕾蕾，孙 艳,2，许志仁,2，范正平，卞 俊*

(1.解放军第四一一医院药学科，上海 200434；2.江西中医学院药学院，南昌 333004)

愈骨疗伤方剂(Yuguliaoshang recipe，YGLS)是由解放军第四一一医院中医科李念群主任医师提供的祖传秘方。该方在治疗过程中，以整体观为主要思想，并根据魏氏伤科学术经验，以早期活血化瘀，中期和血生新，后期固本培元等治疗原则创制。临证立足中医，详细审证，辨证辨病，治伤重视气血，调摄脾胃。本方选用中药川断、骨碎补、土鳖虫、当归、生地、白芍、没药、乳香、鹿角霜、煅自然铜、甘草11味中药组方，具有活血化瘀、续骨愈伤、消肿止痛之功效。用于外伤等引起的骨折、骨碎、骨裂、颈椎病及关节、软组织损伤所引起的肿胀、疼痛等。YGLS作为祖传秘方在本院临床应用30多年，疗效明确。本实验旨在通过药效学研究评价YGLS水提和醇提两种提取工艺，对该方治疗骨折愈合的效果，以筛选出YGLS的最佳提取工艺。

1 材料和方法

1.1 药品和仪器 YGLS醇提取物和水提取物， 均为本院药学科制剂室自制的粉剂， 临用前分别加入蒸馏水配制成混悬液。水提取物3种混悬液的浓度为5.2%、10.6%和21.2%，醇提取物3种混悬液的浓度为3.2%、6.4%和12.8%。伤科接骨片(批号 200906326，大连美罗中药材有限公司)，将其研磨成粉末后加入蒸馏水配制成8%混悬液。麝香接骨胶囊(批号 090301，吉林省辉南天宇药业股份有限公司)，将其研磨成粉末后加入蒸馏水配制成8%混悬液。戊巴比妥钠(批号WS 20110112，美国Sigma公司)；注射用青霉素钠(批号 A110203116，哈药集团制药总厂)。TJL16 离心机(上海安宁科学仪器厂)；Vitro 3350血液生化仪(美国强生公司)； CX31显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 家兔及分组 健康新西兰大白兔60只[第二军医大学动物中心，动物合格证号：SCXK(沪)2007-0007]，雌雄各半，体重为2.0～2.5 kg。采用体重分层随机数字表将家兔分成10组：对照组、模型组、2个阳性对照组(伤科接骨片和麝香接骨胶囊组)、3个YGLS水提取物组和3个YGLS醇提取物组。根据前期预实验结果，YGLS低、中、高剂量分别为0.8、1.6、3.2 g生药/kg体重。水提取物的得率为33%，3个YGLS水提取物组给予水提取物粉末的量为0.26、0.53、1.06 g/kg。醇提取物的得率为20%，3个YGLS醇提取物组给予醇提取物粉末的量为0.16、0.32、0.64 g/kg。

1.3 骨折模型的制备[1]大白兔静脉注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉。仰卧固定后，剪去右侧胫骨处的兔毛，消毒皮肤，用手术刀切开胫骨上方的皮肤，分离肌肉及肌膜，暴露胫骨。用双层钢锯造成新西兰大白兔胫骨中段不完全性骨折，骨折处宽约3 mm，深度为胫骨直径的1/2。缝合皮下组织及皮肤。手术后肌注青霉素钠2.0×105IU/只，共3 d，预防感染。

1.4 给药 各组均于术后第2天开始灌胃给药。对照组、模型组家兔给予蒸馏水，2个阳性对照组家兔分别给予8%伤科接骨片混悬液和8%麝香接骨胶囊混悬液，3个YGLS水提取物组家兔分别给予5.2%、10.6%和22.2%YGLS水提取物混悬液，3个YGLS醇提取物组家兔分别给予3.2%、6.4%和12.8%YGLS醇提取物混悬液。灌胃剂量均为5 ml/kg，1次/d，连续给药30 d。

1.5 观察指标 给药30 d后心脏取血，1388×g离心10 min，分离血清，测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性、血磷和血钙水平。实验结束时取右侧胫骨，X线观察以评价骨折愈合程度，按下列标准进行评分[2，3]：0分 骨完全连接，无骨折线可见。1分 骨折断端边缘消失；骨膜反应密度近似骨影；骨痂填满缺损，与骨皮质密度相同并相互连接。2分 骨折断端边缘仍可见，但接近消失；骨膜反应较深；骨痂增多，但尚未填满缺损，密度加深，边缘较清。3分 骨折断端边缘模糊；骨膜反应浅淡；骨痂少量，密度较淡，边缘不整齐。4分 骨折断端边缘趋向模糊；骨膜轻度反应，无骨痂可见。组织学观察：取骨折断端及周围软骨痂，标本置于4%甲醛中固定，甲酸脱钙，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，用苏木精-伊红染色，在光镜下观察骨痂的变化。

2 结 果

2.1 YGLS对兔骨折局部X影像表现的影响 给药后30 d，模型组家兔胫骨中段可见少量骨痂生长，但未达到骨的完全连接，其骨折线、肌肉肿胀并未完全消失。伤科接骨片组家兔胫骨中段骨痂填满缺损，骨折线随骨痂骨性愈合而消失，肌肉肿胀消失，骨髓腔复原，骨折已基本愈合。麝香接骨胶囊组家兔骨折断端边缘仍可见，但接近消失；骨痂增多，但尚未填满缺损，边缘较清。YGLS水提取物与醇提取物中、高剂量组家兔胫骨中段骨痂填满缺损，骨折线和肌肉肿胀消失，骨髓腔复原，骨折基本愈合，各组家兔骨折愈合的等级见表1。与伤科接骨片一样，中、高剂量YGLS水提物和醇提物组的等级明显低于模型组， 差别有显著意义 (P<0.05)，即中、高剂量的YGLS水提物和醇提物组家兔骨折修复快于模型组，表明YGLS水提物和醇提物有一定的促进骨折愈合作用。

表1 家兔骨折术后使用愈骨疗伤方30 d的X线片观察结果

2.2 YGLS对骨折局部骨组织结构的影响 伤后30 d，模型组骨折断端连接部的成纤维细胞和成骨细胞增生，软骨细胞生长，并伴有软骨细胞的变性和空泡化；部分家兔可见初级骨小梁生成，早期骨痂形成。伤科接骨片阳性对照组可见骨折处骨小梁明显增粗，骨痂形成，髓腔通过；麝香接骨胶囊阳性对照组骨小梁比模型组稍粗，但排列不规则，有骨痂形成。伤后30 d，YGLS醇提取物与水提取物低剂量组家兔骨折缺损处均可见成纤维细胞和成骨细胞生长和增生；所形成的骨小梁大多较细，与模型组相似，均可见早期骨痂形成。YGLS醇提取物与水提取物中剂量组在骨折处均可见成纤维细胞、成骨细胞和软骨细胞增生，并可见软骨细胞的核固缩、空泡变性等；骨小梁大多较模型组略粗，有的交互连接成网，但排列不规则，中央有髓腔通过，骨痂形成。高剂量醇提取物与水提取物组多数家兔的骨小梁普遍较模型组增粗，骨小梁相互连接，有髓腔通过。有少数家兔可见到软骨细胞区，骨小梁也较成熟，该两组家兔骨折修复过程中形成的骨痂有吸收的趋势，呈骨折愈合加快的现象(见图1)。

2.3 YGLS对骨折模型兔血清钙、磷浓度和ALP活性的影响 从表2可见骨折后30 d，与对照组比较，模型组家兔血清ALP活性和血清钙磷浓度乘积明显降低，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较，中剂量YGLS水提组与醇提组家兔血清ALP活性明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量YGLS水提组家兔血清钙磷浓度乘积显著升高，与模型组比较， 差异有统计学意义 (P<0.05)。高剂量YGLS醇提组家兔血清ALP、钙浓度、 磷浓度及钙磷浓度乘积均显著升高，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。YGLS水提组与醇提组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。YGLS各组与阳性对照组(伤科接骨片)相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 愈骨疗伤方对骨折后30 d各组家兔骨组织结构的影响(HE染色，×200)

表2 愈骨疗伤方对骨折后30 d家兔血清碱性磷酸酶活性及钙、磷浓度的影响

Table 2 Effects of Yuguliaoshang recipe on serum alkaline phosphatase activity, the levels of calcium and phosphorus at 30 d after bone fracture in rabbits

表2 愈骨疗伤方对骨折后30 d家兔血清碱性磷酸酶活性及钙、磷浓度的影响

*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较；△P<0.05，与模型组比较；ALP：碱性磷酸酶

ALP(zB/U·L-1)(cB/mmol·L-1)(cB/mmol·L-1)181．00±52．903．38±0．162．24±0．307．57±1．05112．67±31．71＊3．40±0．141．55±0．33＊5．08±1．02＊＊129．00±23．163．56±0．15△1．86±0．546．70±2．17142．00±40．933．48±0．111．43±0．404．99±1．43 131．38±55．923．49±0．211．77±0．416．20±1．63 156．88±37．92△3．54±0．111．76±0．616．28±2．31 162．00±58．84△3．58±0．21△2．00±0．51△7．23±2．19△ 114．25±46．633．37±0．161．71±0．595．77±2．04 146．55±25．86△3．54±0．111．74±0．586．14±2．11 146．13±38．433．54±0．101．94±0．506．84±1．75△

3 讨 论

中医药传统文化博大精深，其通过多成分、多靶点的综合作用发挥治疗效果。但传统的中药剂型汤剂由于不易保存、携带不方便、耗时长等缺点，已远远不能满足临床需要。为了更好地发掘中医药宝库，朝着科学化、现代化道路发展，必须对中药的提取工艺、制备工艺、剂型进行改革。传统中药剂型汤剂采用水煎煮的方式进行提取，但是，在该过程中存在“黑、大、粗”的问题，因此，利用中药现代化的思路进行研究显得尤为重要。作者在前期研究通过正交实验，考察水提、醇提和超声提取3种方式，对方剂中主要有效成分含量的影响[4]。结果显示，醇提时指标成分的含量最高。但是，中药复方作为整体发挥作用，单一指标成分的高低，不能真实地反映其在体内作用的效果。本研究旨在突破传统中药提取工艺评价拘泥于“找成分，测含量”的化学评价模式，采用以药效学为核心的评价方式，从家兔整体水平，对水提工艺和醇提工艺进行比较。

在临床观察骨折愈合的过程中，多以X线片作为主要的评价指标，本研究亦将X线片列为主要的评价指标。从结果可见，在相同生药量(不同的药物提取量)情况下，中、高剂量醇提组和水提组骨痂填满缺损，骨折线随骨痂骨性愈合而消失，表明两种工艺都能在一定程度上促进骨折愈合，且两者的作用程度相当。从病理学检查可见，醇提与水提中、高剂量组均可见骨折缺损处有成纤维细胞、成骨细胞生长和增生；骨小梁随着剂量的增加，而呈现逐渐增粗和骨折愈合加快的现象。

由于在骨折愈合的过程中，成骨细胞大量增生，其分泌的ALP可以渗透入血清，因此，血清ALP可以作为成骨细胞活跃性的指标，即间接反映骨折愈合的指标[5]。另外，骨折愈合必须经过钙化的过程，钙盐的沉积是关键步骤。血清中钙、磷的相互作用，促进钙盐沉积[5，6]。因此，本实验选取两者作为评价骨折愈合的量化指标。从结果可见，醇提的高剂量组能显著提高钙、磷浓度及钙磷浓度乘积，水提的高剂量组能提高钙磷浓度乘积。醇提中、高剂量组和水提中剂量组均能提高血清ALP活性。各给药组之间无显著性差异，表明各给药组对骨折愈合相关血液生化指标的影响作用相当。

从上述研究结果分析可知，在相同的生药量下，醇提物和水提物促进骨折愈合的作用相当。由于醇提和水提的得率不同，导致相同的生药量下，服用的提取物的量不同。即在相同的作用强度下，醇提能较水提降低约40%的服药量(醇提的得率为20%，水提的得率为33%)。因此，YGLS以选用醇提工艺为佳。

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