大黄对急性坏死性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障及肠道菌群的作用研究

李燕 姚萍 邓一芸 廖如奕 席利力 吴浩

研究发现，重症急性胰腺炎(SAP)常并发肠黏膜屏障功能障碍(IBD)[1-2]，出现肠道细菌易位，继发肠源性感染。感染相关并发症导致的病死人数占SAP患者病死总人数的80%[3]。中药大黄作为一种溢清泻下的药物已应用于临床，但其详细机制不清。本研究旨在观察大黄对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肠黏膜屏障及肠道菌群的保护作用。

一、材料与方法

1．实验动物及分组：健康雄性SD大鼠42只购自新疆医科大学动物中心，清洁级，体质量220～280 g。适应性喂养1周后按数字表法随机分为对照组(10只)、ANP组(14只)和大黄治疗组(18只)。采用胰胆管逆行注入 5%牛磺胆酸钠(美国Sigma公司)1 ml/kg体质量的方法制备ANP模型。大黄治疗组大鼠制模后即给予10%熟大黄煎液(我院药剂科配制)灌胃，2 ml/只，每8 h重复给药一次，共3次。对照组大鼠在开腹后仅轻轻翻动十二指肠后关腹。术后24 h常规腹腔麻醉，腹正中开腹，分离肠管，于回盲部取肠系膜淋巴结2枚置入无菌离心管；腹主动脉采血4～5 ml，离心分离血清；于胰头处取胰腺组织、肝右叶取肝脏组织各一份置入无菌离心管，另取胰头处胰腺组织、回盲部回肠组织各一份置10%甲醛溶液中固定；取回盲部粪便标本，液氮速冻，置-70℃冰箱保存。

2．检测指标：(1)腹水量：开腹后用已称重的灭菌干棉球吸尽腹腔腹水，再次称重，两次重量差即为腹水量。(2)细菌易位率：在超净工作台中用匀浆研磨器充分研磨肠系膜淋巴结、胰腺、肝脏组织，然后分别接种于需氧及厌氧培养基，常规行需氧及厌氧培养，24～48 h观察需氧菌生长情况，3～5 d观察厌氧菌生长情况。培养出细菌者为阳性，无细菌生长者为阴性，脏器细菌易位率=细菌培养阳性脏器数/培养脏器总数。(3)血淀粉酶及内毒素测定：由我院动物实验中心检验室测定。(4)胰腺及回肠组织病理学检查：取10%甲醛溶液固定的组织，常规石蜡包埋、切片，HE染色,由两位病理学专业人员双盲法光镜下读片，分别采用Schmidt[4]及Chiu′s[5]标准对胰腺及小肠进行评分。(5)肠腔内菌群数测定：采用实时PCR法定量。应用DNA Stool Mini Kit(QIAamp公司)提取粪便细菌基因组DNA，设计并合成靶向细菌16S rDNAE的引物。大肠杆菌正义引物5′-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3′，反义引物5′-ACCAGGGTATCTTAATCCTGTT-3′，扩增产物340 bp；乳酸杆菌正义引物5′-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3′，反义引物5′-CACCGCTACACATGGAG-3′，扩增产物341 bp；双歧杆菌正义引物5′-TCGCGTC(C/T)GGTGTGAAAG-3′，反义引物5′-CCACATCCAGC(A/G)TCCAC-3′，扩增产物243 bp；针对16S rDNA V3可变区的内参正义引物5′-ACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，反义引物5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′，扩增产物200 bp。PCR反应条件：95℃ 3 min，95℃ 10 s、49.1℃(大肠杆菌)或54.5℃(乳酸杆菌)或62℃(双歧杆菌)30 s、65℃ 1 min，40个循环，72℃延伸5 min。由PCR仪自带软件分析结果，以待测样本菌种表达量与内参表达量的比值表示相对菌群数。

二、结果

1．腹水量及血淀粉酶活性：对照组、ANP组、大黄治疗组大鼠的腹水量分别为(1.4±0.1)、(17.5±2.2)、(11.4±6.7)ml；血淀粉酶活性分别为(2426±240)、(7534±696)、(6491±996)U/L。ANP组显著高于大黄治疗组，大黄治疗组又显著高于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

2．病理变化：对照组大鼠无明显异常。ANP组大鼠可见胰腺不同程度水肿、缺血、坏死,大网膜及后腹膜皂化斑，胃肠明显胀气、肠管明显水肿。大黄治疗组大鼠的胃肠胀气明显缓解。镜下见ANP组大鼠的胰腺腺泡细胞肿胀,灶性坏死，叶间隙增宽，间质微血管破裂、出血，小叶排列紊乱，大量炎症细胞浸润；小肠黏膜明显绒毛坏死、脱落、缺损，大量炎症细胞浸润、毛细血管充血或出血。大黄治疗组大鼠胰腺及回肠病理损伤较ANP组均减轻(图1)。对照组、ANP组、大黄治疗组的胰腺Schmidt评分分别为(0.45±0.41)、(6.83±0.43)、(4.94±1.16)分；回肠Chiu′s评分分别为(1.07±0.77)、(10.29±1.18)、(8.29±0.99)分，ANP组显著高于大黄治疗组，大黄治疗组又显著高于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

图1 对照组(上)、ANP组(中)、大黄治疗组(下)的胰腺(左)及回肠(右)组织的病理改变(HE ×200)

3．肠道菌群数：对照组肠道大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量分别为(4.16±2.58)×10-5、(22.07±15.09)×10-3、(24.42±9.90)×10-5；ANP组为(19.43±7.16)×10-5、(1.33±0.67)×10-3、(9.17±6.83)×10-5；大黄治疗组为(15.93±15.21)×10-5、(22.88±13.65)×10-3、(11.15±4.66)×10-5。ANP组及大黄治疗组肠道大肠杆菌菌群数较对照组均显著增加，而乳酸杆菌、双歧杆菌菌群数均显著减少(P<0.05或<0.01)。大黄治疗组的大肠杆菌较ANP组减少，而乳酸杆菌、双歧杆菌增加，但差异无统计学意义。

4．细菌易位率：对照组仅在肠系膜淋巴结中培养出细菌，阳性率11.1%。ANP组肠系膜淋巴结、胰腺、肝脏细菌培养阳性率及血浆内毒素阳性率分别为90.9%、81.8%、72.3%和54.6%；大黄治疗组分别为63.6%、72.7%、63.6%、9.1%，均显著低于ANP组，两组差异具有统计学意义(P<0.05或<0.01)。

讨论胃肠道是人体的“细菌总库”，一个健康成人的胃肠道细菌大约有1014个，包括需氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌[6]，其中 95%为厌氧菌。正常肠黏膜屏障由黏液层、肠黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接等构成。以双歧杆菌为主的专性厌氧菌定植于黏膜上皮表面，形成菌膜，能阻止条件致病菌(如大肠杆菌)对黏膜的粘附和定植，即具有“定植抗力”[7]。当肠黏膜完整性及保护性菌膜遭到破坏，肠道菌群明显紊乱，表现为大肠杆菌数量明显增加，而双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显减少。以大肠杆菌为主的条件致病菌大量定植于或穿透肠黏膜上皮，进一步加重了肠黏膜损伤，形成恶性循环。SAP时，肠黏膜屏障遭到破坏，固有膜水肿伴大量炎症细胞浸润，肠壁通透性增加，为肠道细菌易位提供便利。

本研究结果显示，SAP大鼠小肠黏膜明显绒毛坏死、脱落、缺损，大肠杆菌菌群数显著增加，而乳酸杆菌、双歧杆菌菌群数均显著减少，肠系膜淋巴结、胰腺、肝脏细菌培养阳性率及血浆内毒素阳性率均显著增加，提示SAP时肠道致病菌增加，益生菌减少，并出现细菌及内毒素易位，与Balzan等[8]的研究结果一致。应用大黄治疗ANP大鼠后，肠黏膜病理损伤减轻；大肠杆菌减少，而双歧杆菌、乳酸杆菌增加；腹腔各脏器细菌易位率及血浆内毒素阳性率均降低，提示大黄对ANP大鼠肠黏膜屏障有保护作用，并可改善肠道内的菌群紊乱，减少细菌及内毒素的易位。

大黄对肠道的保护机制可能为：(1)大黄本身对多种阳性菌、阴性菌及肠道内的厌氧菌有抑制作用,能显著降低血浆及肠道内毒素水平[9]；(2)大剂量大黄作用于胃肠黏膜引起强烈的人工炎症，导致肠黏膜上皮细胞大量增生，绒毛融合，大量炎性细胞浸润，分泌功能增强，在胃肠黏膜表面形成保护膜促进肠黏膜杯状细胞增生及增加肠腔内黏液分泌；(3)改善肠道微循环，降低毛细血管通透性，提高血浆渗透压，达到扩容及改善肠道微循环的目的[9]；(4)大黄可通过其泻下作用增强肠蠕动，缓解胃肠胀气和潴留，清除肠内毒素和细菌；(5)大黄可松驰Oddis括约肌，消除胆源性胰腺炎的病因，还有清除氧自由基作用，诱导胰腺腺泡细胞凋亡，减轻胰腺炎症，促进胰腺细胞修复[10]，并可减少多脏器功能衰竭的发生。

大黄治疗后ANP大鼠肠道内菌群紊乱有好转趋势，但两组间菌群数量的差异并无统计学意义。其原因可能有：(1)SD大鼠个体间差异太大，导致测得的各菌群标准差过大；(2)虽然大黄有调整肠道微生态的作用，但发挥作用需要时间，本研究仅治疗24 h，时间短影响大黄的治疗效果。

参 考 文 献

[1] Liu H，Li W，Wang X，et al．Early gut mucosal dysfunction in patients with acute pancreatitis[J]. Pancreas, 2008,36 (2): 192-196.

[2] 王湘英，张兴文，肖彦，等.清胰汤对急性出血坏死性胰腺炎肠道细菌及内毒移位的影响[J].中国普通外科杂志，2010,19 (3):255-258.

[3] Dambrauskas Z，Gulbinas A，Pundzius J，et al． Meta-analysis of prophylactic parenteral antibiotic use in acute necrotizing panereatitis[J]． Medicina ( Kaunas )，2007,43(4):291-300.

[4] Schmidt J. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J]. Ann Surg,1992, 215(1):44-56.

[5] Chiu CJ, Mcardie AH, Brown R, et al. Intestrinal mucosal lesion in low-flow states[J]. Arch Surg, 1970, 101(4):478-483.

[6] Ohland CL, Macnaughton WK. Probiotic bacteria and intestinal epithelial barrier function[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2010, 298(6):G807-G819.

[7] Romond MB, Colavizza M, Kalach N, et al. Does the intestinal bifidobacterial colonisation affect bacterial translocation[J]? Anaerobe, 2008,14(1):43-48.

[8] Balzan S, de Almeida Quadros C, de Cleva R, et al. Bacterial translocation: over view of mechanicsms and clinical impact[J].J Gastroenterol Hepatol，2007,22(4):464-471.

[9] 林茵绿，杜顺福，蔡元坤.大黄对重症急性胰腺炎大鼠肠道屏障功能保护的实验研究[J].河北中医，2002,24(11)：875-878.

[10] 胡洪勇，李正修. 大黄与硫酸镁治疗重症急性胰腺炎的临床疗效观察[J]. 中国保健营养,2012,22(6):1493.