STAT3基因沉默对胰腺癌细胞株的增殖及对吉西他滨敏感性的影响

潘雪 Thiruvengadam Arumugam Vijaya Ramachandran Craig D Logsdon

吉西他滨目前仍代表着胰腺癌化疗的标准传统方案。然而由于其内源耐药性导致其临床效用一般，因此一系列体外实验尝试检测吉西他滨耐药的分子指标。越来越多的证据显示，信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)在恶性肿瘤的转化中起着重要作用[1-3]。STAT蛋白是细胞内信号转导因子家庭的一员，转导细胞外信号，激活酪氨酸蛋白激酶(JAKs)和酪氨酸激酶受体，而它们又反过来进一步激活STATs。激活的STATs移位至细胞核,从而调节基因转录[4]。文献报道[5]，STAT3在白血病、淋巴瘤、乳腺癌和前列腺癌中表达，抑制STAT3活性可下调它的靶基因Bcl-XL、c-myc和cyclin D1等的表达，诱导肿瘤细胞凋亡。本研究应用RNA干扰技术沉默STAT3基因表达，探讨STAT3基因在胰腺癌细胞株对吉西他滨耐药机制中的作用。

材料和方法

一、材料

人胰腺癌细胞株BxPC3、L3.6pl、CFPAC-1、MPanc-96、PANC1和MiaPaCa-2均购自美国ATCC(American Type Culture Collection)，人胰腺癌上皮细胞(HPDE)由加拿大多伦多大学Tsao博士友情馈赠。除BxPC3在RPMI液中培养外，其他胰腺癌细胞株均在含10%胎牛血清的DMEM液中培养。HPDE细胞在含角质形成细胞的无血清培养液中培养。靶向STAT3的siRNA(siSTAT3)购自Dharmacon Res公司，阴性对照siRNA(siNC)购自Ambion公司。Hiperfect 转染试剂购自Qiagen公司。细胞增殖试剂盒购自Promega公司。

二、方法

1．STAT3活性检测：将癌细胞接种于96孔板，应用前期构建的STAT3荧光素慢病毒、对照的海肾萤光素酶慢病毒感染细胞[6]，获得稳定转染的带荧光素报告基因的胰腺癌细胞株。将感染细胞接种于96孔板，待细胞生长至70%融合后，收集细胞裂解液，应用双萤光报告基因试剂盒(Promega公司)定量检测STAT3及磷酸化STAT3(pSTAT3)的活性。

2．STAT3 基因表达沉默实验：取对数生长期细胞接种于6孔板或96孔板，待细胞长至50%融合时，应用Hiperfect转染试剂将siSTAT3或siNC分别转染癌细胞，在不含抗生素的无血清培养液中孵育48 h，采用蛋白质印迹法确认基因沉默效果。

3．细胞增殖实验：取转染的细胞孵育24 h，加入10 μmol/L的吉西他滨(耐药株)或1 μmol/L的吉西他滨(敏感株)继续培养48 h，应用MTS试剂(Promega公司)检测细胞增殖，以未用吉西他滨处理的细胞数为100%，计算生长抑制率。

4．细胞凋亡检测：取转染siSTAT3或siNC的培养24 h的对数生长期细胞，加入上述浓度吉西他滨后继续孵育72 h，收集细胞，用冷PBS洗涤，应用低张液(0.1% sodium citrate, 0.1% Triton X-100，20 mg/ml RNase，50 mg/ml propidium iodide)孵育30 min，上流式细胞仪EPICS-XO(Beckman Coulter)检测细胞凋亡。

5．蛋白质印迹法：收集转染的胰腺癌细胞，提取蛋白，常规行蛋白质印迹法检测细胞STAT3和pSTAT3(Tyr705)的表达，以β-actin为内参。兔抗人一抗购自Cell Signaling Technology Inc，工作浓度1∶250，荧光标记的羊抗兔二抗IRDye 680购自Santa Cruz Biotech公司，工作浓度1∶100。最后通过Odyssey红外荧光成像仪(Li-Cor Biosciences, Lincoln, Nebraska)检测。

三、统计学处理

结 果

一、胰腺癌细胞株STAT3表达水平及其与吉西他滨耐药性的相关性

根据本研究组以前的研究报道[6]，PANC1、MPanc96、MiaPaCa细胞株为吉西他滨耐药菌株，BxPC3、CFPAC-1、L3.6pl细胞株为吉西他滨敏感细胞株。6株胰腺癌细胞株STAT3及pSTAT3蛋白表达量均显著高于HPDE细胞，但胰腺癌细胞的表达量与其对吉西他滨耐药性无明显相关(图1)。

图1 人胰腺癌细胞株和HPDE细胞STAT3、pSTAT3蛋白表达

二、siRNA转染后胰腺癌细胞的沉默效果

转染siSTAT3的BxPC3、CFPAC、L3.6pl、PANC1、MPanc96、MiaPaCa细胞STAT3蛋白的表达均较转染siNC的相应细胞显著下调(图2，表1)。

图2 转染细胞的STAT3 蛋白表达

三、STAT3基因沉默对胰腺癌细胞增殖、凋亡及与吉西他滨耐药的影响

STAT3基因表达沉默后各胰腺癌细胞的增殖、凋亡均未受影响。但STAT3基因沉默可以增加所有6株细胞对吉西他滨的敏感性，吉西他滨的杀伤效应增加了10%～15%(图3)。

表1 转染细胞的STAT3蛋白表达量

图3 吉西他滨对转染siSTAT3、siNC细胞的增殖(1～6)及凋亡(7～8)的影响

讨 论

肿瘤化疗中一个关键问题是肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。目前明确的是化疗主要是通过上调凋亡、衰老或有丝分裂来诱导细胞周期阻滞或死亡。因为STAT3能够诱导存活蛋白(Survival protein)表达、防止细胞周期阻滞或衰老的发生，因此，推测这种信号途径不仅参与细胞转化过程，而且也可能参与其内源性耐药机制。有研究认为[7-9]，STAT3也许同内源性耐药性有关。

很多胰腺癌患者对联合化疗效果较差的原因主要是胰腺癌细胞存在内源性的化疗药物耐药性。在肿瘤细胞中STAT3被认为是通过抑制凋亡来产生化疗药物耐药性的。一些研究证明，应用Jak2激酶抑制剂AG490抑制STAT3活性均可导致细胞凋亡发生[10-11]。本研究结果显示，STAT3基因沉默的胰腺癌细胞株，不管是对吉西他滨敏感株还是对耐药菌株，其增殖并未受到影响，但其对吉西他滨的敏感性均有不同程度的增加，提示阻滞STAT3信号途径可能会逆转内源性的药物耐药性。

参 考 文 献

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