微弱荧光信号下对色氨酸和酪氨酸溶液的定量分析

高海阔，马盛楠

（1.滨州学院 光电工程系；2.滨州学院 外语系，山东 滨州 256600)

微弱荧光信号下对色氨酸和酪氨酸溶液的定量分析

高海阔1，马盛楠2

（1.滨州学院 光电工程系；2.滨州学院 外语系，山东 滨州 256600)

应用偏最小二乘法，研究了在微弱荧光信号情况下不同的预处理方式和不同建模光谱区间对色氨酸和酪氨酸溶液浓度定量分析结果的影响，发现预处理方式采用平滑、减黑暗响应和减直线操作，然后建模光谱区间采用300-500nm范围内取极值点并对300-400nm进行间隔10nm取值时得到最佳的建模效果.实验最终取得了良好的预测效果：酪氨酸浓度的平均预测误差为5.9%，色氨酸浓度的平均误差为8.1%.

偏最小二乘法；荧光光谱；定量分析

在天然氨基酸中，能够在激发光照射下发射荧光的只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸.色氨酸作为人体的必须氨基酸之一，具有极其重要的生理功能，在医学上可用于抗痉挛，在食品中常用作抗氧化剂;酪氨酸则在机体内起激素和激素受体作用，与神经活动、行为以及大脑皮层的睡眠节律有关.因此，利用它们的荧光特性来测定其含量具有重要的意义.然而由于氨基酸溶液浓度、测量条件等限制，荧光的信号是非常微弱的[1-3].利用微弱荧光信号实现对氨基酸溶液浓度同时测定一直是分析工作者的难题之一.

目前，光谱定量分析的方法主要有多元线性回归（MLR）、逐步回归（SMR），主成分回归（PCR）、偏最小二乘法（PLS）、人工神经网络（ANN）和拓扑（Topological）等.本文采用经典的偏最小二乘法对所获取的微弱的荧光光谱信号进行定量分析，同时测定了色氨酸和酪氨酸的浓度，取得了满意的效果.

1 偏最小二乘法方法原理

设有q个因变量{y1,…,yq}和p自变量{x1,…,xp}.为了研究因变量和自变量的统计关系，我们观测了n个样本点，由此构成了自变量与因变量的数据表X={x1,…,xp}和Y={y1,…,yq}.偏最小二乘回归分别在X与Y中提取出成分t1和u1(也就是说，t1是x1,…, xp的线形组合，u1是y1,…,yq的线形组合).在提取这两个成分时，为了回归分析的需要，有下列两个要求[4]：

（1）t1和u1应尽可能大地携带他们各自数据表中的变异信息；

（2）t1与u1的相关程度能够达到最大.

这两个要求表明，t1和u1应尽可能充分的代表数据表X和Y，同时自变量的成分t1对因变量的成分u1又有最强的解释能力[5].

在第一个成分t1和u1被提取后，偏最小二乘回归分别实施X对t1的回归以及Y对u1的回归.如果回归方程已经达到满意的精度，则算法终止；否则，将利用X被t1解释后的残余信息以及Y被u1解释后的残余信息进行第二轮的成分提取[6].如此往复，直到能达到一个较满意的精度为止.若最终对X共提取了m个成分t1,Λ,tm，偏最小二乘回归将通过实施yk对t1,Λ,tm的回归，然后再表达成yk关于原变量X1,Λ,Xm的回归方程，k=1，2，…，q.

2 实验部分

2.1 样品准备

预先配制各种浓度的酪氨酸和色氨酸的溶液作为测试目标，其浓度如表1所示.

2.2 ．试验系统的组成

本实验采用 AvaSpec-2048型光谱仪. AvaSpec-2048型光纤光谱仪基于AvaBench-75光学平台，采用对称Czerny-Turner光路设计，带有2048个像素的SONY第二代CCD探测器.光谱仪包括光纤接头（标准SMA接口，也可以选择其它类型的接口）、准直镜、聚焦镜和衍射光栅. AvaSpec-2048测 量 波 长 范 围 200-1100nm，AvaSpec-2048型光谱仪适合低亮度和高分辨率的应用领域.

表1 配置的酪氨酸和色氨酸的浓度（单位:1*10-4g/m l）

激发波长采用254nm，由紫外灯加254nm的滤光片配合实现.

荧光器皿为北京金格兰公司生产的石英烧杯.

2.3 光谱预处理方法

光谱预处理即数据预处理是进行建模的一个重要阶段，对每一个建模样品，通常要用多张谱图确定其重复性.如果同一样品的谱图不能被鉴定，必须用数据预处理方法使它们比较相似，以消除偏移或不同线性基线的变化.通过预处理数据，保证光谱数据和含量值之间很好的相关性.一般情况下，无法给出一个常用的数据预处理方法或最适合的数据方法，而是去比较几种数据预处理方法，从中找出最优方法.

所测荧光信号的强度极其微弱，我们从直接测得的信号中很难看出荧光信号，信号全部被淹没在噪声中，如图1（a）所示.

考虑到仪器本身的影响，我们在完全黑暗的情况下测得仪器的响应（以下简称黑暗相应），用原始信号减去黑暗响应可得图1（b）.从图1（b）中可以看出，光谱图的幅值大幅度减小，说明我们有效地降低了噪声的影响，再对上述结果做多次平滑处理，得到图1（c）.

从该图中我们基本可以看清特征峰的位置，但明显的有基线漂移的现象存在，我们对各光谱做减去一条直线的处理得图1（d）；为了更好地去除基线平移的影响，我们在对其做求一次求导处理，得图1（e）；二次求导可以消除基线漂移的影响，经过二次求导后，可得到如图1（f）所示波形.

校正模型的建立是在比较各种分析方法的基础上逐步得到改善的，试验首先进行了光谱预处理方法对校正结果的比较研究，主成分数我们采用预测误差平方和最小时的主成分数，光谱范围采用300-700nm，间隔20nm取值.具体结果如下：

表2 预处理方法对建模结果的影响

图1 各种预处理方法对谱形的影响

从实验结果可以看出，试验在经过平滑、减黑暗响应和减直线操作时的建模效果最好.从表2中的对比结果也可以看出，对样品进行的建模效果的好坏不是由一个特定的方法来确定的.有的处理方法可以改善建模效果，但有的方法不仅不能促进建模效果，而且可能由于本身处理的特点而带入噪声等其他信息，使建模效果降低.因此，建模时应根据不同检测目的、样品状态、仪器性能等情况，选择适宜的数据处理方法，以期获得最佳建模效果.

2.4 光谱范围的选择

我们在对原始光谱做平滑、减黑暗响应和减直线操作的基础上，进行区间范围选择比较研究，根据试验结果分析光谱区选择对校正结果的影响情况.

仍采用预测残差平方和最小时的主成分数.选择区间如下：300-1000nm区间间隔50nm取值、300-700nm区间间隔30nm取值、300-500nm区间间隔 25nm取值、300-500nm区间取极值点、300-500nm区间取极值点+300-400nm间隔10nm取值.

从表3可以看出，在经过300-500nm范围内取极值点，再对300-400nm进行间隔10nm取值时具有最好的建模效果.具体结果如表4.而酪氨酸和色氨酸在254nm波长辐射激发的主要谱形都落在300-500nm范围内，因此这样取值具有很好的合理性.

表3 建模区间对建模效果的影响

表4 偏最小二乘法在最优建模区间时的建模结果

酪氨酸浓度的平均预测误差为5.9%，色氨酸浓度的平均误差为8.1%.

3 结论

一定浓度的酪氨酸和色氨酸的混合溶液在254nm激发波长的激发下发出极其微弱的荧光，本文基于传统的偏最小二乘法，尝试各种预处理方法和光谱范围对该微弱的荧光光谱信号进行处理，并取得了良好的预测效果.预处理方式采用平滑、减黑暗响应和减直线操作，然后建模光谱区间采用300-500nm范围内取极值点并对300-400nm进行间隔10nm取值时取得最佳的建模效果：酪氨酸浓度的平均预测误差为5.9%，色氨酸浓度的平均误差为8.1%.

〔1〕V.I.Tom in.Separation of a weak fluorescence signal of 3-hydroxyflavone using dynamic quenching[J].Optics and Spectroscopy,2009,Vol. 106,No.3:355-358.

〔2〕Jing-Jing W u,Yu-W en Liu,M eng-Xiang Sun. Improved and high throughput quantitative measurements of weak GFP expression in transgenic plant materials[J].Plant Cell Reports, 2011,30:1253-1260.

〔3〕Huili W ang,Jingwen M ao,Ailian Duan et al. Fluorescence Quenching of 4-tert-Octylphenol by Room Temperature Ionic Liquids and its Application[J].Journal of Fluorescence,2013,23: 323-331.

〔4〕Songhui Wang,Bingren Xiang,Yilong Su.Direct determ ination of dichlorvos in water by partial least square-discrim inant analysis[J].Environmental Chem istry Letters,2012,10:383–387.

〔5〕Kanchan Upadhyay,Anupama Asthana,Neetu Tiwari et al.Determ ination of nimesulide in pharmaceutical and biological samples by a spectrophotometric method assisted w ith the partial least square method [J].Research on Chem ical Intermediates,2013,39:3553–3563.

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O657.3

A

1673-260X（2014）04-0007-03

滨州学院科研基金项目（BZXYQNLG201106）