响应面优化超声波提取桑葚酒渣总黄酮的工艺

（韩山师范学院生物学系，广东潮州 521041）

桑葚又叫桑果、桑枣，味甜多汁、风味独特、富含营养，具有增强免疫，促进造血细胞生长，抗诱变，抗衰老，降血糖，降血脂和护肝等多种药理作用，于1993年被卫生部列为既是食品又是药品的水果，属于卫生部规定的开发功能食品的原料[1-3]。黄酮是一类广泛存在于植物中的多酚类物质，是植物在自然选择过程中产生的次级代谢产物，对植物的生长、发育、开花、结果、抵御异物的侵袭起着重要作用。研究表明，黄酮在动物体内表现出广泛的生物活性，不仅具有抗癌、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏以及抑制脂质过氧化作用，还具有抑制血小板凝集和改善毛细管的渗透性及脆性的生理功能[4-5]。超声波辅助提取法提取黄酮是目前较新的提取方法，是利用超声波的空化作用破坏植物细胞和细胞膜结构，从而加强黄酮类物质的释放与溶出，超声波使提取液不断震荡，有助于溶剂的渗入与溶质的扩散，显著提高了桑葚酒渣总黄酮的提取率[6]。本实验在单因素试验的基础上，采用响应面法对桑葚酒渣中总黄酮的提取工艺条件进行优化，为桑葚酒渣中总黄酮超声波辅助提取提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚酒渣：将购于潮州枫春水果批发市场的桑葚进行果酒发酵，发酵结束后用双层纱布将酒渣压榨过滤，将滤渣在60℃条件下真空干燥6 h，并用粉碎机粉碎，过30目筛，得预处理后的桑葚酒渣，冷藏备用。

95%食用酒精、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠：汕头西陇化工有限公司；芦丁（生化试剂）：国家药品生物制品检定所制；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；超声波清洗器SB5200TDT：宁波新芝生物科技股份有限公司；电子分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；YK-12风速中药粉碎机：山东省青州市益康中药机械有限公司；离心机：湖南湘仪有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芦丁浓度及吸光度标准曲线制作[7-8]

精密称取经120℃干燥至恒重芦丁标准品5 mg，用50%乙醇溶解，摇匀并定容至50 mL，配制为0.1 g/L芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。分别取上述芦丁标准液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 25 mL 容量瓶中，用50%乙醇稀释至10 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加入1mol/L NaOH溶液2 mL，用50%乙醇定容，混合后摇匀，放置15 min，以试剂空白为参比，于510 nm处测吸光度值。以吸光度A为纵坐标，芦丁标准液浓度C为横坐标，绘制标准曲线。得到标准曲线方程为：A=8.002 4C-0.000 8，R2=0.999 7。

1.3.2 超声波工艺流程及总黄酮提取率测定

准确称取1.000 g的桑葚酒渣粉于250 mL锥形瓶中，加入一定体积的乙醇溶液摇匀，用保鲜膜将瓶口封住后浸泡3 h，然后采用超声波提取一定时间，抽滤，滤液用50%乙醇定容至100 mL，作为待测液。准确吸待测液1 mL于25 mL的容量瓶中，照芦丁标准曲线方法测定吸光度，计算样品总黄酮的提取率。

1.3.3 单因素试验

以原料总黄酮提取率为测定指标，选用不同浓度的乙醇溶液、提取温度、料液比、超声波功率及提取时间作为影响因素，在保持其他因素不变的条件下进行单因素试验，考察各因素对原料总黄酮提取率的影响，筛选最佳提取工艺。

1.3.4 响应曲面试验[9-10]

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，在单因素试验基础上采用5因素3水平响相应面法分析桑葚酒渣总黄酮提取条件，试验设计因素及水平见表1。

1.3.5 统计分析[9]

二次多项式回归分析和方差分析由Design Expert 7.0软件完成。

表1 桑葚酒渣总黄酮响应面试验设计因素水平表Table 1 Factors and levels tested in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对桑葚总黄酮提取率的影响

分别采用浓度为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇为提取溶剂，在提取温度60℃、料液比1∶30（g/mL）、超声波功率350 W、提取时间80 min的条件下用超声波辅助法提取桑椹酒渣总黄酮，考察乙醇浓度对桑葚总黄酮提取率的影响。

图1 乙醇体积分数对桑葚酒渣总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

由图1可知，乙醇体积分数对桑椹酒渣总黄酮的提取率有显著影响，乙醇体积分数的增大，可引起细胞的结构变化，脂溶性黄酮类化合物的溶解性也增大，有利于黄酮的提取，当乙醇体积分数为70%时提取率达到最高点，而后随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取率降低。因此乙醇体积分数为70%时总黄酮的提取率最佳。

2.1.2 超声温度对总黄酮提取率的影响

以70%乙醇为提取溶剂，在料液比1∶30（g/mL），超声波功率350 W，提取时间为80 min，提取温度分别设置为 40、50、60、70、80、90 ℃，考察超声温度对桑椹酒渣总黄酮提取率的影响。由图2可知，在超声温度低于70℃时，随着温度的升高，总黄酮的提取率有显著提高，温度高于70℃后，随着温度的升高总黄酮提取率趋于下降。这是因为在较低温度下，物质分子热能较低，不利于活性物质溶出；当温度过高时，一些热敏性组分被破坏，另外高温条件下超声振动也破坏活性物质结构，导致总黄酮提取率下降，因而超声温度应选择70℃最佳[11-12]。

图2 超声温度对桑葚酒渣总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic extraction temperature on extraction rate of total flavonoids

2.1.3 料液比对总黄酮得率的影响

以70%乙醇为提取溶剂，在提取温度70℃、超声波功率350 W、提取时间80 min的条件下，分别采用料液比为 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL），考察料液比对桑椹酒渣总黄酮提取率的影响。

图3 料液比对桑葚酒渣总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids

由图3可知，料液比对桑椹酒渣总黄酮提取率有影响，当料液比小于1∶30（g/mL）时，提取率随着料液比的增加而增加。由于有效成分浓度梯度增大，扩散速率提高，有利于提取率的提高，当料液比超过1∶30（g/mL）后提取率开始下降，而且料液比的增加将会加大后期浓缩的时间和能耗，所以选择料液比1 ∶30（g/mL）最佳。

2.1.4 超声功率对总黄酮得率的影响

以70%乙醇为提取溶剂，在提取温度70℃、料液比 1∶30（g/mL）、超声时间 80 min的条件下，分别采用超声波功率为 200、250、300、350、400 W，考察超声波功率对桑椹酒渣总黄酮提取率的影响。由图4可知，在200 W～350 W之间，随着超声功率的增大，总黄酮的提取率也逐渐增加，当超声功率达到350 W之后，总黄酮提取率开始下降，而且继续增加超声功率也会增加能源的消耗。因此，超声功率选择350 W为宜[13]。

2.1.5 超声时间对总黄酮得率的影响

以70%乙醇为提取溶剂，在超声温度70℃、料液比1∶30（g/mL）、超声波功率350 W的条件下，分别提取 20、40、60、80、100 min，考察超声时间对桑椹酒渣总黄酮提取率的影响。

图4 超声波功率对桑葚酒渣总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasomic power on extraction rate of total flavonoids

图5 超声时间对桑葚酒渣总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic extraction time on extraction rate of total flavonoids

由图5可知，在超声时间为20 min～80 min之间，随着提取时间的增大，总黄酮的提取率也逐渐增加，当提取达到80 min之后，总黄酮提取率增加幅度不大，继续增加提取时间反而会降低总黄酮的溶出。因此，超声时间选择80 min为宜。

2.2 方差分析

2.2.1 响应面试验结果分析

以乙醇浓度（A）、超声温度（B）、料液比（C）、超声波功率（D）、超声时间（E）为自变量，以桑葚酒渣总黄酮提取率（Y）为响应值进行设计试验，响应面试验结果见表2。

表2 超声波辅助提取桑葚酒渣总黄酮工艺响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for surface analysis

续表2 超声波辅助提取桑葚酒渣总黄酮工艺响应面试验设计及结果Continue table 2 Experimental design and results for surface analysis

2.2.2 二次相应面回归模型的建立与方差分析

采用Design-Expert 7.0软件对表2试验数据进行回归拟合分析。为了得到更精简的模型，对模型分析中二次项影响不显著的项进行剔除，然后再进行方差分析，得到响应面试验结果的精简模型方差分析见表3。

从表3可以看出，AC、BC、A2、B2、C2、D2、E2对响应值影响显著，说明乙醇浓度和料液比，温度和料液比分别有交互作用，说明乙醇浓度、温度、料液比是总黄酮提取过程中的关键控制因素。失拟项p=0.075 2没有显著性意义，说明数据中没有异常点，不需要引入更高次数的项，模型适当。该决定系数R2=0.985 6，表明该模型的拟合度好，建模成功。

表3 精简模型方差分析及显著性检验结果Table 3 ANOVA for the simple developed regression mode

根据精简模型可建立回归方程为：

Y=5.11-0.014A-0.012B+0.018C+0.003125D-0.014E-0.048AC-0.038BC-0.41A2-0.39B2-0.38C2-0.40D2-0.41E2

2.2.3 响应面分析

为了更直观的表现两个因素同时对总黄酮提取率的影响，可以令其他因素水平值为零，仅考虑这3个因素水平价值为零，即进行降维分析，得到的二元二次方程可以绘出相应的响应面图和等高图，由图6可知，响应面开口向下，随着每个因素的增大，响应值增大，当响应值增大到极值后，随着因素的增大，响应值逐渐减小，该模型有稳定点，且稳定点是最大值。

2.2.4 模型确认及验证试验

通过Design-expert编程得到的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度 75%，温度69.95℃，料液比1∶29.8（g/mL），超声功率350 W，超声提取时间79.2 min，理论预测值总黄酮得率为4.68%。值得注意的是表2中的试验41～46的提取率较理论值（4.68%）大，原因是响应面模型是大样本统计值，而试验41～46得出的只是单一试验值，从统计学意义上来讲不具代表性[14-15]。

参照理论上的最佳提取工艺条件，并根据实际情况进行调整：乙醇浓度75%，温度70℃，料液比1∶29 g/mL，超声功率350 W，超声提取时间79 min，进行3次平行验证试验，所得试验结果平均值为4.71%。实测值与理论值极为接近。

图6 各两因素交互作用对桑葚酒渣总黄酮提取率影响的相应面及等高线Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of pairwise interactions various process conditions on extraction rate of flavonoids

3 结论

根据Box-Behnken试验设计原理，利用Design-Expert 7.0.1软件，优化后得到的预测结果与实验结果较吻合。优化后得到提取桑葚酒渣总黄酮的最佳工艺参数为：乙醇浓度75%，提取温度70℃，料液比1∶29（g/mL），超声波功率350 W，提取时间79 min，在此条件下，桑葚酒渣总黄酮的提取率为4.71%。通过本试验可获得桑葚酒渣总黄酮的优化提取工艺条件，为桑葚酒渣中总黄酮超声波辅助提取提供了理论依据。

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