重庆地区儿童急性腹泻相关博卡病毒的基因类型及其流行特征调查

赵 进，黄豆豆，李思思，郭辰涛，许红梅，张小爱，刘 玮

重庆地区儿童急性腹泻相关博卡病毒的基因类型及其流行特征调查

赵 进1，黄豆豆1，李思思1，郭辰涛1，许红梅2，张小爱1，刘 玮1

目的了解重庆地区急性腹泻患儿博卡病毒(human bocavirus, HBoV)的基因型和流行特征，为HBoV相关腹泻的防控提供依据。方法以重庆医科大学附属儿童医院为哨点医院，收集2011年急性腹泻儿童患者的粪便样本504份，使用荧光定量PCR筛选阳性标本，使用巢氏PCR方法对阳性标本进行扩增，对扩增序列进行序列比对并建立进化树进行基因分型。结果504份腹泻标本中，49份为HBoV阳性，阳性率为9.72%。不同季节HBoV的检出率不同，夏季检出率(19.72%)最高(P=0.003)。序列比对和进化树结果提示49份HBoV阳性标本中，HBoV1、HBoV2和HBoV3的例数分别25、23和1，其中检出的23份HBoV2全部为HBoV-2B型。结论不同季节HBoV的检出率不同，其中夏季病毒检出率最高；重庆地区检出的 HBoV以HBoV1型和HBoV2B型为主。

博卡病毒；急性儿童腹泻；调查研究；基因型

人博卡病毒(human bocavirus, HBoV)属于细小病毒科，是最近发现的可以引起人类急性胃肠炎的新发病原体[1]。HBoV无包膜，衣壳蛋白呈二十面体对称，蛋白内包含一条长为5300 bp的线性单链DNA，主要编码非结构蛋白NS1和NP1，结构蛋白VP1和VP2[2]。目前，国内缺乏重庆地区儿童急性腹泻相关HBoV的研究[3-5]。本研究以重庆医科大学附属儿童医院作为监测哨点医院，对2011-01到2011-12急性腹泻的儿童进行HBoV的调查研究，以了解重庆地区儿童腹泻相关HBoV的型别及其流行特征。

1 材料和方法

1.1 病例定义 按照WHO对于急性腹泻的定义纳入研究对象：24 h内有3次及3次以上的水样便或者稀便，腹泻持续时间小于2周。同时排除炎性胃肠道疾病、脂泄病、囊胞性纤维病、食物中毒或者有明显的呼吸系统症状和体征者[3]。

1.2 标本采集与检测 符合纳入标准的病例经知情同意后，采集患者急性期粪便标本。样本使用PBS进行1∶10稀释后取200 μl腹泻稀释液提取核酸。病毒核酸的提取使用QIAamp® MinElute® Virus Spin Kit (Cat.NO. 57704)试剂盒。荧光定量PCR筛选HBoV阳性标本，引物分别为HBoV1r和HBoV1f。阳性标本使用巢氏PCR扩增博卡病毒核酸长度为454 bp的NS1片段。第一轮引物为HBoV2-sf1 (AACAGATGGGCAAGCAGAAC) 和HBoV2-sr1 (AGGACAAAGGTCTCCAAGAGG)； 第二轮引物为HBoV2-sf2 (TGCTTCAACAGGCAAAACAA) 和 HBoV2-sr2 (TCCAAGAGGAAATGAGTTTGG)[6]。PCR扩增产物测序后进行BLAST序列比对，并从GenBank下载国内外HBoV的参考株序列，使用MEGA 5.1 建立进化树，确定博卡病毒的基因型。

1.3 信息收集 使用标准调查问卷，由临床医师对符合纳入标准的病例从病历中抽取相关信息，主要包括患者年龄、性别、出生日期和发病日期。

1.4 统计学处理 数据录入使用Epidata 3.0 录入数据，建立腹泻数据库。数据分析使用SPSS17.0。不同组儿童之间HBoV检出率的比较使用卡方检验或者Fisher检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 流行状况 共收集腹泻标本504份，其中49份为HBoV阳性，阳性率为9.72%。不同性别之间HBoV的检出率无统计学差异(P=0.656)。不同年龄段之间HBoV的检出率无统计学差异(P=0.280)。

不同季节的HBoV的检出率不同，夏季HBoV的检出率最高，秋季HBoV的检出率最低(P=0.003，表1)。

2.2 病毒分型及其基因特征 根据BLAST比对和NS1核酸序列进化树的结果(图1)，检测到的HBoV分为3型，HBoV1 和HBoV2最多，HBoV3最少，仅1株。重庆地区腹泻HBoV1与呼吸道的HBoV1有很高的同源性(98%～100%)。检测到HBoV2属于HBoV-2B型，与FJ375129/Shanghai和FJ973559/Nigeria在进化树上有很高的同源性。检测到1株HBoV3型病毒，与病毒株JN086998/USA的同源性高达100%(表2)。

表1 2011年重庆地区HBoV感染儿童的性别、年龄和季节分布

图1 2011年重庆地区HBoV感染NS1区核酸序列进化树

表2 重庆地区不同HBoV基因型的检出率和组内同源性

3 讨 论

急性腹泻是5岁以下儿童的常见疾病，具有很高的发病率和病死率。世界范围内每年有超过7亿5岁以下儿童发生急性腹泻，超过200万儿童死于急性腹泻，占儿童死亡人数的19%[6- 8]。HBoV是最近发现的可以引起人类急性胃肠炎新发病原体，分为4个型，分别为HBoV1-4型，HBoV2型又进一步分为HBoV2A和HBoV2B两个组[1,9,10]。HBoV1主要从呼吸道检测出，HBoV2主要从粪便样本中检测出，HBoV3和HBoV4只是偶尔被检测到[1,11]。 HBoV在世界范围内腹泻的检出率为0.8%～25.6%[2-5,10,11]。我国首次于上海地区2008年腹泻标本中检测到HBoV2，其HBoV1和HBoV2的检出率分别为5.3%和5.0%；我国首次从北京儿童医院2006-2007年的腹泻样本检测到两株HBoV3，另外HBoV1、HBoV2和HBoV3的检出率分别为2.5%、9.5%和0.5%。兰州地区是HBoV2的高发地区，HBoV1、HBoV2和HBoV3的检出率分别为4.3%、20.4%和0.9%；苏州地区HBoV的检出率为6.1%[3-5,10]。但是，尚缺乏重庆地区儿童急性腹泻相关HBoV的研究。在本次监测中，重庆地区HBoV1、HBoV2和HBoV3的检出率分别为4.96%，4.56%和0.20%，总HBoV的检出率与上海地区相近，低于兰州地区和北京地区[3-4,10]。重庆地区不同性别和年龄段腹泻儿童的HBoV检出率没有差异。不同季节HBoV检出率不同，夏季HBoV的检出率最高，与广州和苏州地区调查研究报道的7～8月份为检出率高峰基本一致[5]。

依据博卡病毒NS1片段建立进化树，对HBoV进行基因分型。结果显示，HBoV1和HBoV2B是腹泻儿童患者最常见的基因型。HBoV1同组之间有很高的同源性，HBoV2同组之间也有很高的同源性，从同源性可以看出HBoV1和HBoV2的基因序列相对保守。重庆地区急性腹泻样本中，HBoV1是最主要的检出基因型，与呼吸道检出的HBoV1有很高的同源性(98.0%～100%)。HBoV2的检出率仅低于HBoV1，在本研究中检测到23株HBoV2全部属于HBoV-2B型，并且与上海的FJ375129和尼日利亚的FJ973559有很高的同源性，而北京地区和苏州地区的检出的HBoV2为HBoV-2A型，提示不同地区的腹泻患者感染的HBoV2型可能存在差异[3,5]。本研究同时还检测到一株HBoV3，与美国的JN086998的同源性高达100%。

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(2014-06-04收稿 2014-07-08修回)

(责任编辑 武建虎)

InvestigationofhumanbocavirusinpediatricpatientswithacutediarrheainChongqing,China

ZHAO Jin1, HUANG Doudou1, LI Sisi1, GUO Chentao1, XU Hongmei2, ZHANG Xiaoai1, and LIU Wei1.

1. State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, China; 2. Department of Infection Gastroenterology,Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014, China

ObjectiveTo investigate the prevalence, genotypes and epidemic characteristics of human bocavirus associated with acute pediatric diarrhea in Chongqing area.MethodsPediatric patients with acute diarrhea were recruited and stool samples were collected in Children’s Hospital of Chongqing Medical University during 2011. Real-time PCR and nested PCR were performed to determine the presence of HBoV and their genotypes.ResultsA total of 504 stool specimens were collected, from which 49 HBoV positive samples were identified, with a detection rate of 9.72%. A seasonal distribution of HBoV was observed, with a peak (19.72%) in summer. No distribution of age or gender specific was obtained for the HBoV positive detection. Based on Blast and MEGA analysis, 25 HBoV1, 23 HBoV2 and 1 HBoV3 were determined. All the HBoV2 strains detected belonged to HBoV-2B genotype.ConclusionsThe detection rate of HBoV has obvious seasonality, with a peak in summer. HBoV1 and HBoV-2B are the major genotypes.

human bocavirus; acute pediatric diarrhea; investigation; genotype

国家十二五传染病重大专项 ( 2013ZX1004-202)，军队后勤科研基金课题(BWS11C073)

赵 进，硕士研究生，E-mail: phage1@163.com

1.100071北京，军事医学科学院微生物流行病研究所；2.400014，重庆医科大学附属儿童医院

刘 玮，E-mail: lwbime@163.com

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