P63蛋白在肺癌中表达的定量分析及其与癌细胞凋亡的关系

王 璐，申 洪

P63蛋白在肺癌中表达的定量分析及其与癌细胞凋亡的关系

王 璐1，申 洪2

目的 对P63蛋白在正常肺脏及肺癌组织中的分布进行定量分析，判断其表达与细胞凋亡的关系。方法 收集肺癌组织标本及肿物周围正常肺组织，制备组织芯片。以免疫组织化学方法鉴定P63表达并进行量化分析；以脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法判断细胞凋亡并进行量化分析；最终将结果量化为阳性单位(PU)进行分析。结果 肺鳞癌细胞核P63的PU值大于正常肺支气管上皮、肺腺癌、大细胞癌、小细胞癌细胞核P63的PU值(P<0.01)；肺腺癌、大细胞癌、小细胞癌的PU值小于正常肺支气管上皮细胞核P63的PU值(P<0.01)；正常肺组织中P63的表达与细胞凋亡之间无相关关系(r=0.1619，P>0.05)；肺癌组织中P63的表达与细胞凋亡呈正相关(r=0.3333，P<0.001)。结论 正常肺组织中P63的表达量和细胞凋亡是两个独立存在的事件；而肺癌组织中P63的表达与细胞凋亡呈正相关。

P63；肺癌；凋亡；定量分析

P63是近几年发现的P53家族新成员，它编码结构和功能不同的异构体。其中，全长表达的P63蛋白能激活P53相关靶基因，阻遏细胞周期和诱导细胞凋亡。而N端被截短的P63蛋白却拮抗P53和全长表达的P63的功能。P63基因在肿瘤发生、细胞凋亡和组织发育的研究中备受关注[1-3]。以往研究中对P63在肺癌中的表达研究仅为定性观察，揭示了其在不同类型肺癌中的表达情况，但其表达的量化特点及基于量化改变的变化规律尚未见报道[4-6]。本研究利用组织芯片技术和图像分析技术定量测试P63在肺癌中的表达情况，从量化角度揭示P63在正常肺及不同类型肺癌中的表达特点, 探索其变化规律，在此基础上利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(Tdt-mediated dUTP Nick-End labeling,TUNEL)技术对肺癌组织芯片进行原位细胞凋亡检测并作相应定量测试分析，从量化角度探讨P63与细胞凋亡在肺癌发生、发展过程中的作用及两者之间的相关关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集南方医院病理科2003-01至2005-12肺癌组织活检标本100例，另取肿物周围正常肺组织8例，患者术前未接受任何辅助治疗。分组如下:正常肺组8例；肺癌组100例，男57例,女43例；年龄21～76岁,平均57岁。按世界卫生组织肺癌组织学分类法(1999年)将肺癌组进一步分为腺癌组(35例)、鳞癌组(42例)、大细胞癌组(12例)和小细胞癌组(11例)。TNM分期：Ⅰ期59例，Ⅱ～Ⅳ期41例。标本均新鲜取材，中性甲醛溶液固定,石蜡包埋。

1.2 方法

1.2.1 组织芯片制作 制作1个15×28阵列的含432个组织芯的蜡块，组织微阵列制作仪为美国Beecher Instruments公司MTA-1型。

1.2.2 P63的免疫组化检测及定量分析 采用标准SP法进行免疫组化染色。鼠抗人P63单克隆抗体(即用型)、SP试剂盒和DAB试剂盒均购自福州迈新公司，PBS取代一抗做空白对照，用肺鳞癌组织做阳性对照，在确定无假阳性和假阴性的前提下以细胞核成棕黄或棕褐色为阳性。

1.2.3 原位凋亡细胞检测 应用TUNEL技术检测正常肺支气管上皮及肺癌细胞凋亡，原位凋亡细胞检测试剂盒购自美国Boehringer公司。光镜下观察，细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性细胞即凋亡细胞。

1.2.4 P63及凋亡细胞定量分析 应用美国徕卡公司Leica Q500MC图像分析系统，在40倍物镜下，每个样本随机选取20个视野，每例样本共测试200个阳性细胞，用交互式测量方法测量每个阳性细胞胞核的灰度值Gα，同时在相应的20个视野中测试背景灰度并取其平均值Gβ，按公式PU=[(Gα-Gβ)/Gmax]×100计算每个阳性细胞胞核的阳性单位PU值。其中Gmax为设定的灰度最高级，取每个样本中200个阳性细胞PU值的均值作为此样本的阳性单位PU值。

1.3 统计学处理 用SPSS13.0统计分析软件包进行数据处理，采用方差分析及直线相关对数据进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 P63在正常肺组织及肺癌组织中的表达 正常肺支气管上皮细胞核P63的PU值小于肺鳞癌细胞核P63的PU值(P<0.01)；肺腺癌、大细胞癌、小细胞癌细胞核P63的PU值均小于正常肺支气管上皮细胞核P63的PU值(P<0.01)；肺大细胞癌细胞核P63的PU值与肺腺癌细胞核P63的PU值相比差异无统计学意义(P=0.747)；肺小细胞癌细胞核P63的PU值均小于肺腺癌、鳞癌、大细胞癌细胞核P63的PU值，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

2.2 细胞凋亡在正常肺组织及肺癌组织中的表达 细胞凋亡在正常肺组织及肺癌组织中的表达程度不同,差异有统计学意义(H=51.981，P<0.01)。正常肺上皮凋亡细胞胞核的PU值均大于肺腺癌、鳞癌、大细胞癌、小细胞癌凋亡细胞胞核凋亡的PU值(P<0.01)；肺大细胞癌凋亡细胞胞核的PU值均小于肺腺癌、鳞癌、小细胞癌凋亡细胞胞核的PU值(P<0.01)；肺小细胞癌凋亡细胞胞核的PU值均小于肺鳞癌、腺癌凋亡细胞胞核的PU值，差异有统计学意义(P<0.01)。肺鳞癌与肺腺癌凋亡细胞胞核的PU值之间比较，差异无统计学意义(表1)。

表1 正常肺组织与肺癌中P63PU值 与细胞凋亡PU值情况 ±s)

2.3 P63表达与细胞凋亡之间的相关关系 正常肺组织中P63的表达与细胞凋亡之间无相关关系(r=0.1619，P>0.05)；肺癌组织中P63的表达与细胞凋亡之间呈正相关关系(r=0.3333，P<0.001)。

3 讨 论

P63对人类生长发育的调控可能通过与P53和P73的相互配合而起重要作用。正常生理情况下，P63蛋白在人类组织中广泛存在,其异构体的分布各不相同，且呈广泛而有选择性地表达,如肺、皮肤、骨髂、肌肉、乳腺、胸腺、淋巴细胞、神经组织、消化系统和泌尿生殖系统等,尤其在增生的上皮细胞内多见[7]。Glickman等[8]发现,在食管鳞状细胞中,P63 的上调可能对鳞癌的形成起重要作用。Massion等[9]用荧光原位杂交及免疫组化组织微阵列方法检测了217例非小细胞肺癌中的P63表达,并对其中24例进行了RT-PCR检测和Western Blotting 分析,以及对41例尚未发生浸润的鳞状上皮病变进行P63基因及蛋白检测,发现88%的鳞状细胞癌、42%的大细胞肺癌及11%的肺腺癌中出现P63基因扩增,且主要为ΔNp63α; Western Blotting表明ΔNp63α主要在正常支气管和鳞状细胞癌中表达，与细胞增殖密切相关。国内很多实验室也开展了P63的相关研究，但多数只是定性，缺少对P63表达的定量分析[10-12]。传统的定性分析方法具有简单易行，结果判定重复性良好等优点，不足之处主要在于结果受诸多主观因素干扰，易致误差。定量分析技术对结果的判定更客观、精确，人为因素干扰少，可重复性好，但对切片质量要求更高，阳性定位要准确，对非特异性背景染色要有很好的控制[13-15]。因此，定量分析技术可作为形态学定性分析的有益补充，尤其在肿瘤病理学诊断和预后的研究中可能发挥更大的作用。

本研究应用图像分析系统，对正常肺组织和肺癌组织中P63阳性的细胞表达强度进行定量测试。结果表明，肺鳞癌细胞胞核P63的PU值大于肺腺癌、大细胞癌、小细胞癌及正常肺上皮细胞胞核P63的PU值，肺小细胞癌细胞胞核P63的PU值均小于其他各组，差异均有统计学意义。肺腺癌与大细胞癌P63的PU值之间无统计学差异。根据P63在肺鳞癌细胞中表达强度最高，在正常肺支气管上皮基底细胞中的表达相对较弱，在肺腺癌、大细胞癌及小细胞癌中的表达强度较低的这一结果，笔者推测P63过表达与肺鳞状细胞癌形成有密切关系，对于鳞癌的分型有一定的标志作用。

细胞凋亡是由于体内外某些因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞主动性死亡方式[16]，因而又称程序性细胞死亡。本研究通过相关性检验观察肺癌中P63的表达与细胞凋亡之间的相关关系，发现肺组织中P63的表达与细胞凋亡之间不存在明显的相关关系，提示P63的表达量和细胞凋亡是两个独立存在的事件。但是肺癌组织中P63的表达与细胞凋亡之间呈正相关关系，提示肺癌中P63表达水平与细胞凋亡具有相关性。肺癌细胞的凋亡和P63之间究竟通过何种机制发生关联，尚需要进一步研究和探讨。

[1] Joerger A C, Rajagopalan S, Natan E,etal. Structural evolution of P53, P63, and p73: implication for heterotetramer formation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(42):17705-17710.

[2] Thomason H A, Zhou H, Kouwenhoven E N,etal.Cooperation between the transcription factors P63 and IRF6 is essential to prevent cleft palate in mice[J].J Clin Invest, 2010,120(5):1561-1569.

[3] Huang W,Liu K.P53 family proteins provide new insights into lung carcinogenesis and clinical treatment [J].Zhongguo Fei Ai Za Zhi, 2013,16(8):422-426.

[4] Kim D H, Kwon M S. Role of fine needle aspiration cytology, cell block preparation and CD63, P63 and CD56 immunostaining in classifying the specific tumor type of the lung[J].Acta Cytol, 2010, 54(1):55-59.

[5] Shimada Y, Ishii G, Nagai K,etal. Expression of podoplanin, CD44, and P63 in squamous cell carcinoma of the lung[J]. Cancer Sci, 2009,100(11):2054-2059.

[6] NapsinA.TTF-1、CK5/6、CK7、P63在非小细胞肺癌支气管镜活检标本中的表达及意义[J].肿瘤防治研究,2013,40(1):76-78.

[7] Yao J Y,Chen J K. Roles of P63 in epidermal development and tumorigenesis[J]. Biomed J,2012,35(6):457-463.

[8] Glickman J N, Yang A, Shahsafaei A,etal.Expression of P53-related protein P63 in the gastrointestinal tract and in esophageal metaplastic and neoplastic disorders[J]. Hum Pathol, 2001,32(11):1157-65.

[9] Massion P P, Taflan P M, Jamshedur S M,etal. Significance of P63 amplification and overexpression in lung cancer development and prognosis[J].Cancer Res, 2003, 63(21):7113-7121.

[10] 梁喜林，孟 晓，赵 红.前列腺良恶性病变中P504S、P63、CK34βE12表达的研究[J].武警医学,2010,21(3):200-201.

[11] 刘换新,王彩霞,刘 梅.宫颈毛玻璃细胞癌临床病理观察[J].武警医学,2013,24(2):139-142.

[12] 万蔚平, 赵妍妍, 吴开松.P63和CK5/6在肺癌组织中的表达及临床意义[J].中华临床医师杂志, 2014,8(3):444-447.

[13] Jacobs J J, Lehe C , Cammans K D,etal. An automated method for the quantification of immunostained human Langerhans cells[J]. J Immunol Method, 2001,247(1-2):73.

[14] Huang F,Shen H.Inter random number generator-based true random number generator[J].Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao,2004,24(9):1091-1095.

[15] 韩 伟.TGF-β1和PTEN在非小细胞肺癌组织中的表达及相关关系定量分析[J].中国体视学与图像分析,2014,19(1):63-69.

[16] Pavlovic V, Sarac M. The role of ascorbic acid and monosodium glutamate in thymocyte apoptosis[J].Bratisl Lek Listy, 2010，111(6):357-360.

(2014-07-05收稿 2014-07-20修回)

(责任编辑 尤伟杰)

Quantitative analysis of p63 expression in lung cancers and its relationship with cancer cellular apoptosis

WANG Lu1and SHEN Hong2.

1. Outpatinet Department of Fuxing Road No.7, The First Affiliated Hospital of PLA General Hospital, Beijing 100869, China; 2. Department of Pathology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

Objective To analyze the expression of protein p63 in normal lung and lung cancers quantitatively and judge its relationship with cellular apoptosis. Methods Lung cancer and normal lung tissues were collected and tissue arrays were prepared. The p63 expression was determined by immunohistochemistry and analyzed quantitatively. The cellular apoptosis was analyzed quantitatively by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL). The final qualified results (positive unit, PU) were analyzed statistically. Results The PU values of the intensity of p63 protein expression in normal lung tissue, adenocarcinoma, large cell carcinoma and small cell carcinoma were all lower than that in squamous carcinoma (P<0.01); The PU value of normal lung tissue was higher than those in adenocarcinoma, large cell carcinoma and small cell carcinoma (P<0.01); while there was a positive correlation between P63 protein expression and apoptosis in all kinds of lung cancer (P<0.01). Conclusions The extents of protein p63 expression are distinct on the normal lung and lung carcinoma tissues. The p63 expression and cellular apoptosis on the normal lung tissues are separated. However, p63 expression and cellular apoptosis on the lung malignant tissues are positively correlated.

p63；lung cancer；apoptosis；quantitative analysis

王 璐，硕士，医师，E-mail:luwang6@126.com

1.100869北京，解放军总医院第一附属医院复兴路7号门诊部；2.510515广州，南方医科大学病理学系

申 洪，E-mail:shenhong2010168@163.com

R734.2