IL-6基因启动子区-634C/G多态性与糖尿病视网膜病变的关系

安新焕，梁干雄，武会娟

论 著

IL-6基因启动子区-634C/G多态性与糖尿病视网膜病变的关系

安新焕1，梁干雄1，武会娟2

目的 探讨白细胞介素-6(IL-6 gene ，IL-6)基因启动子区-634C/G多态性与中国广东地区汉族人糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者视网膜病变(diabetic retinopathy ,DR)的关系。方法 在中国广东地区汉族人中，应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP )方法,对245例2型糖尿病(T2DM)患者，其中正常眼底即DR0组153例，非增殖期视网膜病变即DR1组51例，增殖期视网膜病变即DR2组41例，和101例健康对照者(NC组)的IL-6基因启动子区-634C/G多态性进行了检测，并比较分析各组间基因型频率和等位基因频率以及相关临床资料。结果 (1)DR0、 DR1、 DR2三组间在年龄、性别、血压、体重指数、腰臀比、空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白A1c、血脂等指标均无统计学差异，而病程在三组间差异具有统计学意义(F=19.05，P<0.05)。(2) 基因型GG在NC、DR0、DR1、DR2各组间差异有统计学意义(χ2=20.839，P=0.002)，DR1、DR2组GG基因型明显高于DR0组，差异有统计学意义(χ2=7.615，P=0.022)；等位基因G在NC、DR0、DR1、DR2各组间差异有统计学意义(χ2=11.687，P=0.009)，但两组间比较差异无统计学意义。(3)Logistic回归分析表明，IL-6基因启动子区-634G/G 基因型、病程及空腹血糖是DR发生的危险因素。结论 在中国广东地区汉族人中，IL-6基因启动子区-634 G/G基因型是DR的遗传危险因素。

白细胞介素-6基因；启动子区；多态性 ；糖尿病视网膜病变

视网膜病变(diabetic retinopathy ,DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见且难治的并发症之一, 在欧美各国四大致盲眼病中占第二位, 在我国也是主要致盲病之一[1]。DR的发病机制主要和环境与遗传因素有关。炎性反应的核心细胞因子IL-6在房水和玻璃体液中的浓度与DR的严重程度高度相关。有研究表明[2]，IL-6基因启动子区存在-643C/G多态性，且与IL-6表达有关,目前有关此多态性与DM视网膜病变的关系未见报道。为此，笔者选取2012-01至2013-03我院住院患者245例，就此多态性进行检测，旨在探讨IL-6基因启动子区-634C/G多态性是否与中国广东地区汉族人DR存在关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象 所有患者均符合1991年WHO T2DM诊断标准且彼此间无亲缘关系。按眼底镜检查结果分为无DR组(DR0组)、非增殖期DM视网膜病变组(DR1组)和增殖期DM视网膜病变组(DR2组)。无DM、高血压病家族史，且血糖、血脂、血压均正常者作为对照组(NC组)。DR0组153例，男77例，女76例，平均(50.74±14.69)岁；DR1组51例，男19例，女32例，平均(55.06±13.81)岁；DR2组41例，男17例，女24例，平均(61.12±9.62)岁； NC组健康对照者101名，男56名，女45名，平均(47.51±8.21)岁。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 选用QIAamp DNA Mini kit试剂盒按说明书提取模板DNA。

1.2.2 IL-6基因启动子区-634C/G多态性检测 采用PCR-RFLP方法检测。引物参照kitamura等[2]报道的文献设计，由北京市理化分析测试中心合成，上游引物为：5′-GAGACGCCTTGAAGTAACTG-3′，下游引物为5′-AACCAAAGAT GTTCTGAACTGA-3′。PCR反应体系：模板1 μl，其余组分的最终浓度分别为dNTP 56 μmol/L，引物(一对)30 μmol/L，Taq DNA聚合酶5 U,10倍的反应缓冲液5 μl, 镁离子2.0 mmol/L，加双蒸水至50 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s,共30个循环，终末延伸72 ℃， 5 min。在BIO-RAD S1000基因扩增仪(美国BIO-RAD公司生产)中进行PCR，产物经2%琼脂糖凝胶电泳证实，然后以限制性内切酶MbiI(BsrBI)进行消化9 h，消化产物经2%琼脂糖凝胶电泳(电压80 v，时间45 min)及溴化乙锭染色后采用Gel Doc 1000紫外检测系统(美国BIO-RAD公司)观察结果(图1)。

图1 酶解后琼脂糖凝胶电泳

M为DNA分子量标记；1、4为GG基因型，2、8为CG基因型，3、5、6、7为CC基因型

PCR扩增的目的片段长度为180 bp，据酶切后产生片段长度的不同判断基因型，CC基因型为180 bp一条片段，CG基因型为180 bp 、120 bp、 60 bp 三条片段，GG基因型为120 bp和60 bp两条片断(60 bp片段看不到)。对酶切后确认基因型为CC型和GG型的两份标本进行测序(图2)，以证实酶切后确认的基因型是否正确 。

A

B

1.2.3 临床及生化指标检测 全自动生化分析仪检测血糖、血脂，用亲和层析法测HbA1C，测量身高、体重、腰围、臀围，并计算体重指数(body mass index ，BMI)和腰臀比(waist hip ratio, WHR)。

2 结 果

2.1 DM三组临床及生化指标比较 由表1可见，DR0 、DR1、 DR2三组在年龄、血压、BMI、WHR、空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)、餐后2 h血糖( 2 hour postprandial plasma glucose,2 hPG)、糖化血红蛋白A1c(glycosylated hemoglobin A1c,HbA1C)、三酰甘油(triacylglycerol,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)等指标均无统计学意义，但病程三组间比较差异具有统计学意义(F=19.05，P<0.05)。

2.2 各组间基因型频率和等位基因频率比较 由表2可见，基因型GG在NC、DR0、DR1、DR2各组间有统计学差异(χ2=20.839，P=0.002)，DR组GG基因型明显高于DR0组， 且具有统计学意义 (χ2=

7.615，P=0.022)；等位基因G在NC、DR0、DR1、DR2各组间有统计学差异(χ2=11.687，P=0.009)，但两两组间比较无统计学意义。

2.3 DR相关危险因素的Logistic回归分析 IL-6基因启动子区-634G/G基因型、病程及空腹血糖是DR发生的危险因素，见表3。

表1 糖尿病视网膜病变各组间临床资料对比 ±s)

注： 与DR0组比较，①P<0.05；与DR1组比较，②P<0.05

表2 糖尿病视网膜病变各组IL-6基因频率和等位基因 (n;%)

注：表内显示例数(频数)

表3 Logistic回归分析结果

3 讨 论

DR在我国是主要致盲病之一。我国DM 患者中DR发生率为25.12%, 且初诊的T2DM患者中DR发生率就高达12.14%。正因为如此，DM及DR已成为世界各国疾病防治和研究的重点，在我国显得尤其重要。

DR的发病机制是环境和遗传因素共同作用。DM发生后，由于高血糖的作用，葡萄糖自身氧化、蛋白质非酶糖基化增强，多元醇通路激活，抗氧化系统清除能力减弱，氧化应激增强，使单核细胞产生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)增多，促炎性反应转录因子-核因子-кB(transcription factor nuclear factor-к,BNF-кB)活性增强，从而产生炎性反应，使炎性反应细胞因子IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor ,TNF)-α等增加，引起炎性反应的放大及恶性循环。越来越多的证据显示，糖基化终末产物(glycation end products,AGEs)和其受体(RAGE)结合能诱导细胞内氧化应激，引起炎性反应和( 或) 血栓形成，参与DM血管病变发病机制。在DM视网膜病变晚期，AGEs不可逆转地在视网膜毛细血管细胞内堆积，AGEs和RAGE相互作用激活核转录因子NF-κB，继而生成过量ROS并激活caspase 3，进一步引起细胞损伤并触发细胞凋亡[3]。作为炎性反应的核心细胞因子IL-6，DM视网膜病变患者泪液中IL-6表达量明显高于DM无视网膜病变患者[4]，其在房水、玻璃体及泪液中的浓度与DR的严重程度高度相关[5],并且活动性DM增殖期视网膜病变(PDR) IL-6水平明显高于静止PDR[6,7]。最近研究发现，血清中IL-6在DM及非增殖期DM视网膜病变患者中无差异，而在增殖期DM视网膜病变患者中明显升高[8]；彭湾湾等[9]也发现，血清IL-6含量与DR的严重程度呈正相关；体外培养视网膜Muller细胞显示：糖化蛋白终末产物可引起视网膜Muller细胞产生IL-6，并且存在剂量依赖关系，IL-6的增加与DR的发生发展密切相关。

DR 的显著特征是血-视网膜屏障损害, 研究发现血-视网膜屏障损害与细胞 因子之间存在着密切关系。高血糖首先引起的是眼局部血液动力学的改变, 继之大量糖基化终末产物诱导产生大量的细胞因子, 引起视网膜组织缺血, 血-视网膜屏障破坏导致视网膜病变的产生。IL -6可能是 DR 的主要介质, 通过诱导血管内皮生长因子促进新生血管形成和增加血管渗透性, 同时通过改变内皮细胞形态来增加内皮细胞通透性, 与DR 严重程度密切相关[10]。

本研究结果显示，NC组GG基因型频率高于DR0组，这种差异具有统计学意义，随着病情加重，GG基因型频率有增高的趋势，但差异无统计学差异。为评价IL-6基因启动子区-634C/G多态性和一些临床因素与DR的关系，用逐步选择法作Logistic回归分析表明IL-6基因启动子区-634G/G 基因型、空腹血糖及病程是DR发生的危险因素。在中国广东地区汉族人中，IL-6基因启动子区-634 G/G基因型是DR的遗传危险因素，而在其他地区汉族人中未见报道，在广东地区少数民族人口中亦未见报道。等位基因G在NC、DR0、DR1、DR2各组间差异有统计学意义，但两两组间比较差异无统计学意义。由此可见，等位基因G与DR的发生发展关系不大。

有学者在IL-6 基因-634C/G多态性研究中进行体外单核细胞培养时，发现GG基因型携带者的单核细胞IL-6含量及分泌能力均明显增加，进一步提示IL-6 基因与DR的密切关系[2]。然而，DR患者IL-6基因表达和产物产生的精确机制并不十分清楚，IL-6与DM 、DR的关系，尚待深入探讨。

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(2014-04-10收稿 2014-08-11修回)

(责任编辑 郭 青)

Association of IL-6 gene promoter region -643C/G polymorphism with diabetic retinopathy

AN Xinhuan1,LANG Ganxiong1, and WU Huijuan2.

1.Department of Diabetes，Zhongshan People’s Hospital, Zhongshan 528400, China; 2. Beijing Physical and Chemical Analysis and Testing Center, Beijing 100094,China

Objective To investigate the association of IL-6 gene promoter region -643C/G polymorphism with diabetic retinopathy. Methods The polymorphism of IL-6 gene promoter region -634 C/G in 245 unrelated Guangdong Han people with type 2 diabetes ,including 153 cases without diabetic retinopathy (DR0 group) ,51 cases without proliferative diabetic retinopathy (NPDR)(DR1 group), 41 cases with proliferative diabetic retinopathy (PDR) (DR2 group), and 101 normal controls(NC group) were detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) methods. The genotype frequency, allele frequency and relative clinical data were compared between groups. Results (1)There were no significant differences in the clinical characteristics except for diabetic duration among DR0， DR1， DR2 groups. (2) The frequencies of IL-6-643 G/G genotype and G allele frequencies among DR0 DR1 DR2 groups were statistically different. There were significantly different in GG genotype between DR0 and DR group,comparison between any two means were not significant differences in G allele frequencies.(3) Logistic regression analysis showed that IL-6 gene promoter region-643G/G genotype，fasting plasma glucose and diabetic duration were risk factors of DR. Conclusions The IL-6 promoter region-643G/G genotype may be a genetic risk factor of DR development.

IL-6 gene; promoter region; polymorphism; diabetic retinopathy

广东省中山市科技局基金资助项目(2006A035)

安新焕，硕士，副主任医师，E-mail:axh1998@sina.com

1. 528400，广东省中山市人民医院内分泌科，2. 100094，北京市理化分析测试中心

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