高压氧干预对大鼠创伤性脑损伤后脑组织NF-κB (p50)表达的影响

杨柏林，王 欢，彭 军，徐其明，余 超

高压氧干预对大鼠创伤性脑损伤后脑组织NF-κB (p50)表达的影响

杨柏林，王 欢，彭 军，徐其明，余 超

目的 观察高压氧干预(hyperbaric oxygenation treatment, HBOT)对大鼠创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)后NF-κB(p50) 表达的影响，并探讨其机制。方法 将35只SD大鼠完全随机分为假手术对照组(Con组)5只、创伤组(TBI)15只、高压氧干预组(HBOT)15只。采用Allen’s改良法制造大鼠自由落体重型脑损伤模型，Con组仅切开头皮去骨窗，TBI组给予撞击损伤，HBOT组于创伤后给予高压氧治疗。利用Western-blot法分别于伤后8 h及1、3、5、8 d检测脑组织NF-κB的表达。结果 与Con组比，TBI组各时点脑组织NF-κB表达均升高(P<0.05)，损伤后3 d达高峰(0.7267±0.0305)，5～8 d仍维持较高水平(0.5567±0.0603)。HBOT组各时点NF-κB 表达水平均较TBI组下降(P<0.05)。结论 高压氧干预可以减弱创伤后脑组织NF-κB(p50)表达，有效抑制炎性反应，为重型颅脑损伤治疗提供理论基础。

重型颅脑损伤；高压氧；大鼠；NF-κB

颅脑创伤(traumatic brain injury,TBI)后继发性脑损伤是影响脑外伤预后的重要因素之一。继发性脑水肿及脑损伤可进一步加重神经功能损害，其中炎性反应在继发性损害中发挥着重要作用。核转录因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)作为诱导炎性反应及细胞存活的重要转录因子，在脑损伤后表达增加，通过一系列信号级联反应，参与继发性脑损害及神经保护的双重作用[1,2]。近年来，高压氧(hyperbaric oxygen, HBO)已被广泛应用于临床。研究表明，对颅脑损伤患者辅以HBO治疗时间窗越早，提高生存率、降低伤残率，改善认知功能及提高疗效越显著[3,4], 但具体作用机制未完全清楚。本研究通过观察损伤脑组织NF-κB的表达变化及高压氧干预后对其变化的影响，以期为高压氧治疗重型颅脑损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料及设备 兔抗人NF-κB(p50)多克隆抗体，HRP标记的二抗，GAPDH内参(Santa Cruz公司)，Western-blot制胶试剂盒，ECL显色液，UVP凝胶成像分析系统。

1.2 实验动物分组及处理 选择健康成年雄性SD大鼠35只，体重约280 g。按照完全随机分组原则分为假手术对照组(Con组)5只、创伤组(TBI组)15只和高压氧干预组(HBOT组)15只。Con组：即以假手术组作为对照组，仅切开头皮后去除骨窗而不致脑损伤。HBOT组：致重度脑损伤，损伤后1 h内给予第1次高压氧治疗，以后每天1次。TBI组：致重度脑损伤，与HBOT组不同之处是高压氧舱加压后气缸内用压缩空气替代氧气。TBI、HBOT组大鼠分别于致伤后8 h及1、3、5、8 d断头处死，各时间点分别处死3只；Con组大鼠各时间点处死1只，取标本进行Western-blot检测NF-κB(p50)蛋白表达。

1.3 建立大鼠重型脑损伤模型 参照Chu等[5]研究：大鼠麻醉后，头顶部备皮，局部消毒，固定于立体定向支架上。沿中线切开头皮，矢状窦右侧1 mm及前囟后方1 mm交界于右顶骨，去除直径6 mm的骨瓣。撞击设备安装于支架上，通过从20 cm高处释放圆柱形硾条(重30 g，直径4.5 mm)，撞击矢状窦右侧4 mm及前囟后4 mm交点处，造成右侧大脑重型损伤。海绵胶止血，缝合头皮。

1.4 高压氧治疗 HBOT组大鼠致伤后1 h，放入连有给氧装置的气缸内，将100%的纯氧加压升至2.4 kPa，在该压力下维持1 h。将一盘碳酸钙晶体置入气缸内，用于降低CO2的积聚，使氧浓度在98%以上，CO2在0.03%以下。脑损伤后1 d，HBOT组大鼠再次暴露于100%纯氧中1 h，以后1次/d，直至第8天最后一组实验结束[6]。TBI组大鼠放于同样的气缸内，仅呼吸空气。

1.5 Western-blot实验 取创伤边缘3 mm内的脑皮质(不包含直接损伤区域)，RIPA裂解液与组织混匀进行裂解，4 ℃、12 000 r/min条件下离心组织匀浆20 min，收集上清，Bradford方法测蛋白浓度，取30 μg蛋白样品进行电泳分离，经电转膜仪转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉常温封闭30 min，5%脱脂奶粉稀释的兔抗人NF-κB(p50)抗体(1∶1500稀释)4 ℃孵育过夜，次日TBST洗膜3次，5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(1∶3000稀释)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL方法显色，曝光，用凝胶成像分析系统扫描分析蛋白条带，以GAPDH作内参，分别计算各组A值(标本灰度值/内参灰度值) 。

1.6 统计学处理 用Microsoft Excel及SPSS13.0统计软件进行数据处理，采用析因设计的方差分析和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大体观察 大鼠在冲击致伤后均立即呈现去大脑强直状态，重度脑损伤表现,脑挫裂伤灶明显，范围广泛，合并有颅脑出血。

2.2 Western blot检测分析结果 不同时间点各组脑组织NF-κB(p50)蛋白表达：结果显示Con组内可见微弱的NF-κB(p50)蛋白条带，TBI组NF-κB(p50)表达不同程度地增强，损伤后8 h已见蛋白表达升高，第3天达高峰，之后开始下降，5～8 d仍维持较高水平；相较于TBI组，NF-κB(p50)在HBOT组各对应时点的表达有所减弱(P<0.05或P<0.01，图1及表1)。

图1 大鼠颅脑创伤后不同时间点脑组织NF-κB(p50)蛋白表达变化

与Con组比较，不同时间点上TBI组及HBOT组NF-κB表达均不同程度增加；而在相同时间点上，HBOT组较TBI组NF-κB表达减弱。内参GAPDH在各时间点表达无差异，可控制蛋白上样引起的误差

表1 高压氧干预对大鼠颅脑损伤后不同时间点上损伤脑组织NF-κB表达的影响比较

注：与TBI组比较：①P<0.01，②P<0.05；与Con组相比，③P<0.05

3 讨 论

核转录因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)是广泛存在于真核细胞中的转录因子Rel蛋白家族的成员，其中p50和p65两个亚单位是哺乳动物细胞中最主要的，可以被诱导的异源二聚体[7]。NF-κB具有多向性转录激活功能，静息状态下以非活性形式存在于细胞浆中，当受到应激性刺激、炎性反应细胞因子和氧自由基等多种活化因素激活后，由胞质移位至胞核，与相应的靶基因结合，进而促进效应细胞释放大量细胞因子和炎性介质，参与应激、炎性反应及细胞凋亡等脑损伤病理生理过程。

急性重型颅脑损伤患者NF-κB表达水平明显升高，说明参与了脑水肿形成，并与脑损伤程度密切相关，可作为脑外伤严重程度及预后的评估指标[8]。本研究结果表明，对照组NF-κB蛋白条带灰度值很低，损伤后8 h可见NF-κB的灰度值增大，损伤后1～3 d可发现NF-κB明显表达。由此可知，NF-κB于损伤后的8 h表达已增加，1～3 d其表达明显增强，伤后5～8 d仍呈高表达状态。虽然其具体时间点上变化与以往报道稍有不同，可能与标本处理时间点的选择、检测标本数量、动物抗打击能力等因素有关，但一定程度上表明NF-κB在脑外伤后继发性脑损伤的病理生理过程中起了重要作用。脑损伤后NF-κB高表达，可能与突发致伤应激、继发炎性反应、氧自由基等刺激有关，通过激活某些相关信号转导通路活化NF-κB的表达。活化的NF-κB又可刺激多种炎性介质和细胞因子释放，形成一种彼此相互作用的信号传导网络，进一步加重脑损伤。研究表明，脑损伤后小胶质细胞和巨噬细胞激活，通过TLR-4/MyD88/NF-κB信号级联反应通路，导致损伤脑组织中促炎因子释放及神经细胞凋亡[9]，活化的NF-κB增加促炎因子TNF-α和IL-1β的表达，生成的TNF-α和IL-1β又反过来再刺激NF-κB活性，形成一种正反馈机制，不断放大炎症信号，在血脑屏障的完整性、脑水肿中发挥重要作用[10,11]。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)是一种嗜中性粒细胞趋化因子，可以调节白细胞和内皮细胞间的黏附性，促进白细胞从毛细血管后微静脉向炎性病灶迁移，脑损伤后其水平增加与NF-κB介导转录相关，参与了脑损伤后继发性炎性反应[11]。脑损伤后神经元和胶质细胞中的NF-κB活性增加，还可诱导促凋亡因子P53、COX-2、Fas配体等产生，经凋亡信号级联反应，最终激活caspase导致神经细胞凋亡[12]。减弱NF-κB及相关炎性反应因子的表达，能显著降低TBI后的炎性反应，并改善实验大鼠的预后[1]。

高压氧已被广泛用于临床治疗重型颅脑损伤，对患者的认知功能、损害神经功能的康复有显著效果[3]。HBO减轻动脉闭塞引起的脑梗死及神经功能缺失损害具有剂量相关性，通过增加血液循环中氧浓度，增高损伤脑组织中氧供应，改善脑部微循环，促进能量物质ATP产生，增强Na+-K+-ATP酶的活性，进而减少脑缺血后谷氨酸盐及氧自由基的积聚通过抑制炎性反应的细胞因子生成，减轻或避免脑损伤后继发性损害，降低了脑外伤患者病死率及伤残率[13-15]。长期重复的HBO治疗能够诱导实验性脑损伤大鼠的髓鞘明显再生，并恢复其感觉运动功能[16]。最新研究[6,14]具体探讨了高压氧对大鼠缺血及缺血-再灌注损伤治疗的可能机制：治疗剂量下的高压氧通过抑制NF-κB、p38及c-JUN激酶等信号通路的活化，并通过降低活性氧、酶促氧化物及氮化物水平、脂质过氧化反应及增高酶促抗氧化物水平来减轻氧化性损害；通过降低TNF-α、IL-1β和CD44表达水平及髓过氧化物酶活性，抑制炎性反应状态；再者，HBO可促进抗炎细胞因子，如IL-10的表达发挥抗炎作用。本研究显示，HBOT组NF-κB蛋白条带灰度值较TBI组在同时间段均有明显降低；然而相较Con组，其水平仍呈一种过表达状态，说明高压氧干预对NF-κB的表达起到了抑制作用，提示治疗剂量HBO可抑制NF-κB的进一步活化发挥其抗损伤作用；但与此同时脑损伤后维持NF-κB的高表达，表明机体可能通过内源性的抗损伤机制在一定程度上诱导NF-κB的活化来对抗所受到的损伤。因此，在关注脑损伤后活化的NF-κB参与了炎性反应致继发性损伤的同时，也必须意识到NF-κB的过表达在一定程度上起到脑保护的功能。

研究表明，高压氧干预后NF-κB(p50)在脑组织细胞中表达增加，实验大鼠脑水肿情况及损伤程度较外伤对照组明显减轻[17]，说明HBO可通过增强NF-κB(p50)活性对损伤神经细胞起到保护、修复的治疗作用。Kassed等[18]报道NF-κB(p50)基因敲除小鼠海马神经元对脑损伤的反应性受到影响，其记忆、学习能力降低。Li和Duckworth等[2,19]敲除小鼠NF-κB(p50)亚单位后，大脑中动脉长期闭塞后的梗死面积及死亡细胞数量明显增加，脑损伤程度加剧。

脑损伤后NF-κB水平升高既有可能与脑损伤应激、损伤后继发炎性反应及氧化损害等刺激活化相关；也有可能是反应性地激活不同亚单位，通过增加某些抗凋亡因子的合成和分泌，阻断细胞凋亡，进而发挥脑保护作用。高压氧已用于临床重型颅脑创伤治疗，在今后临床工作中，是否可以通过监测NF-κB水平，从而个性化选择高压氧治疗起始时间、加压程度和治疗周期以期达到最大疗效。因此，如何监测及确定NF-κB在何种水平能够准确提示脑损伤程度及判断高压氧治疗后的炎性反应程度，还有待进一步研究。

[1] Mao S S, Hua R, Zhao X P,etal. Exogenous administration of PACAP alleviates traumatic brain injury in rats through a mechanism involving the TLR4/MyD88/NF-κB pathway[J]. J Neurotrauma, 2012, 29(10):1941-1959.

[2] Li J, Lu Z, Wei L,etal. Cell death and proliferation in NF-kappaB p50 knockout mouse after cerebral ischemia[J]. Brain Res, 2008, 1230:281-289.

[3] 徐 雁，马建忠.不同时间窗高压氧治疗对颅脑损伤患者预后及认知功能的影响[J]. 中国现代医生，2013, 51(33): 25-27.

[4] 钟 诚,王 彬,刘 宇,等. 高压氧治疗对重型颅脑损伤患者脑血管血流动力学参数影响[J]. 中国实用神经疾病杂志, 2013, 16(19):28-30.

[5] Chu W, Li M, Li F,etal. Immediate splenectomy down-regulates the MAPK-NF-κB signaling pathway in rat brain after severe traumatic brain injury[J]. J Trauma Acute Care Surg, 2013, 74(6):1446-1453.

[6] Zhang Y, Lv Y, Liu Y J,etal. Hyperbaric oxygen therapy in rats attenuates ischemia-reperfusion testicular injury through blockade of oxidative Stress, suppression of inflammation, and reduction of nitric oxide formation[J]. Urology, 2013, 82(2):489.e9-489.e15.

[7] Pereira S G, Oakley F. Nuclear factor-kappaB1: Regulation and function[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2008, 40(8):1425-1430.

[8] 郑仲贤，詹传伟，罗维平, 等.急性重型颅脑损伤患者核因子NF-κB表达及其临床意义[J]. 广东医学，2011, 32 (12):1698-1706.

[9] Zhu H T, Bian C, Lin J K,etal. Curcumin attenuates acute inflammatory injury by inhibiting the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway in experimental traumatic brain injury[J]. J Neuroinflamm, 2014,11:59.

[10] Lv Q, Fan X, Xu G,etal. Intranasal delivery of nerve growth factor attenuates aquaporins-4-induced edema following traumatic brain injury in rats[J]. Brain Res, 2013, 1493:80-89.

[11] Li H P, LI W, Hang C H,etal. Expression of intestinal myeloid differentiation primary response protein 88(Myd88) following experimental traumatic brain injury in a mouse model[J]. J Surg Res, 2013, 179(1):e227-e234.

[12] Campos-Esparza M R, Sanchez-Gomez M V, Matute C. Molecular mechanisms of neuroprotection by two natural antioxidant polyphenols[J]. Cell Calcium, 2009, 45(4):358-368.

[13] Yang Z J, Xie Y, Bosco G M,etal. Hyperbaric oxygenation alleviates MCAO-induced brain injury and reduces hydroxyl radical formation and glutamate release[J]. Eur J Appl Physiol, 2010, 108(3):513-522.

[14] Chen L F, Tian Y F, Lin M T,etal. Repetitive hyperbaric oxygen therapy provides better effects on brain inflammation and oxidative damage in rats with focal cerebral ischemia[J]. J Formos Med Assoc, 2014, 14:106.

[15] 王水平，陶 珍，邵先安，等.高压氧治疗对中重型颅脑损伤患者血清-1β和白介素-6影响及疗效分析[J]. 中华物理医学与康复杂志，2012, 34(7):520-523.

[16] Kraitsy K, Uecal M, Schaefer U,etal. Repetitive long-term hyperbaric oxygen treatment(HBOT) administered after experimental traumatic brain in rats induces significant remyelination and a recovery of sensorimotor function[J]. Plos One, 2014,9(5):97750.

[17] 温剑峰, 钱锁开, 雷万生, 等. 高压氧治疗大鼠脑外伤后脑组织NF-κB(P50)表达的实验研究[J]. 中华神经医学杂志, 2009, 8(10):1015-1018.

[18] Kassed C A, Willing A E, Garbuzova-Davis S,etal. Lack of NF-B p50 exacerbates degeneration of hippocampal neurons after chemical exposure and impairs learning[J]. Exp Neurol, 2002, 176(2):277-288.

[19] Duckwortha E A, Butler T, Pennypacker K R,etal. NF-κB protects neurons from ischemic injury after middle cerebral artery occlusion in mice[J]. Brain Res, 2006, 1088(1):167-175.

(2014-06-26收稿 2014-08-20修回)

(责任编辑 梁秋野)

Effect of hyperbaric oxygenation treatment on expression of NF-κB p50 in the rat brain tissue after traumatic brain injury

YANG Bolin, WANG Huan, PENG Jun, XU Qiming, and YU Chao.

Department of Neurological Surgery,Jiangxi Provincial Corps Hospital,Chinese People’s Armed Police Forces，Nanchang 330030, China

Objective To observe the effect of hyperbaric oxygenation treatment(HBOT) on expression of NF-κB(p50) in the rat brain tissue after traumatic brain injury(TBI) and discuss its mechanism. Methods Thirty-five Sprague-Dawley rats were divided into sham operation control group(5 rats), TBI group(15 rats) and HBOT group(15 rats). Based on the Feeney’s model of modified Allen’s method, experimental animals were treated with HBOT. The animals were sacrificed at the 8th hour, and on days 1,3,5,8,respectively. The expression of protein NF-κB was determined by Westernblotting. Results The expression of NF-κB was significantly higher in traumatic group than that in control group at the time of 8 hour and 1,3,5and 8 days after injury (P<0.05).The level of NF-κB reached peak on the 3th day, and maintained a high status from 5 to 8 days. Compared with traumatic group, the NF-κB level was significantly lower in the HBOT group (P<0.05). Conclusion HBOT can weaken NF-κB expression in traumatic brain tissue and inhibit effectively inflammatory response, which provides theoretical basis for treating severe traumatic brain injury.

severe brain injury; hyperbaric oxygenation; rats; NF-κB

杨柏林，本科学历，主任医师，E-mail:jxncy62@163.com

330030南昌，武警江西总队医院神经外科

R651.11