重组人hSERCA2a基因腺病毒载体构建和包装

王红丽， 李志强， 周贤慧， 许国军， 汤宝鹏

(新疆医科大学第一附属医院1临床医学研究院， 2心脏起搏电生理科, 乌鲁木齐 830054)

肌浆网钙ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase,SERCA2a)是心肌细胞胞内钙代谢的主要调节蛋白，在心肌收缩和舒张中起着关键作用。将携带SERCA2a基因的病毒感染衰竭的心肌细胞使心肌组织中SERCA2a基因表达上调，改善心肌舒缩功能，因此通过转导SERCA2a基因治疗心衰已成为当今的一个热点[1]。腺病毒是一种安全可靠的载体，其具有病毒滴度高、包装容量大、细胞感染范围广等显著的特点，通过病毒注射可以直接增加细胞内目的基因表达。本研究借助腺病毒作为载体，构建重组人SERCA2a(human SERCA2a,hSERCA2a)腺病毒载体，为SERCA2a基因治疗心力衰竭的动物实验及临床试验研究提供方法学基础。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂人胚肾293(human embryo kidney cell culture，HEK293)细胞、大肠杆菌DH5α、腺病毒穿梭质粒pshuttle-CMV、骨架质粒pAdEasy(深圳市百恩维生物科技有限公司)。携带hSERCA2a基因的载体(Stratagene)，限制性内切酶、T4连接酶(NEB)、质粒提取试剂盒、大肠杆菌JM109感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，脂质体Polyfectine(深圳百恩维生物科技有限公司)，其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.2病毒载体构建设计hSERCA2a引物，扩增出基因hSERCA2a。由Invitrogen 公司合成引物rAd-hSERCA2-SacII-F:5′-TCCCCGCGGCACCAT-GGAGAACGCGCACACCAAGACGGTGGAGG-3′；rAd-hSERCA2-SalI-R:5′-CGCGTCGACCTCCAGTATTGCAGGTTCCAGGTAGTTGCGGGCCAC-AA-3′。扩增条件：95 ℃变性4 min，95℃变性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃延伸7 min。腺病毒穿梭质粒pshuttle-CMV分别用SalⅠ+SacⅡ双酶切，回收酶切产物。2次回收产物用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化JM109感受态细胞，获得pshuttle-CMV-EGFP-hSERCA2a重组载体。摇菌，提取质粒进行 DNA测序鉴定。将重组载体用PacⅠ单酶切线性化，回收酶切产物，转化已含有pAdEasy的BJ5183 感受态细胞进行同源重组获得重组质粒pAdEasy-EGFP-hSERCA2a，挑取阳性克隆进行DNA测序鉴定，再进行病毒包装。

1.3腺病毒的包装将质粒pAdEasy-EGFP-hSERCA2a转化JM109感受态细胞，挑取单克隆菌液、摇菌，大提质粒。取20 μg质粒DNA用PacⅠ线性化，37℃酶切过夜，采用酚氯仿抽提，无水乙醇沉淀方法纯化DNA ，紫外分光光度计测定纯化质粒浓度。线性化质粒转染HEK293细胞，细胞的密度达到80%～90%时进行转染。转染后第2天，观察荧光比例并确定转染效率。细胞长满培养皿时，将细胞进行传代于细胞培养瓶中，用含5%胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每天观察细胞出毒迹象。待细胞90%病变时收集细胞和培养基，用反复冻融方法使病毒从细胞中释放出来，收集含有病毒的上清液。

1.4重组腺病毒的滴度测定在滴度测定前1 天取48孔板，加入携带目的基因重组腺病毒载体的HEK293细胞。用DMEM完全培养基10倍梯度稀释病毒。取96孔板，每孔含有90 μL培养基，第1横排孔每孔加入10 μL待测病毒原液，混匀后吸取10 μL混合液至第2横排孔，如此稀释至第8横排孔(表1)。吸取10 μL病毒混合液加入到相对应的48孔板中，重组腺病毒rAd-SERCA2a含有绿色荧光蛋白，经48 h感染后，可以在荧光显微镜下检测到绿色荧光蛋白的表达，用荧光显微镜计数。在最高稀释梯度m孔中数出n(n<10)个带荧光的细胞，则病毒滴度为n×10m/mL(m为稀释梯度)，若n>10，则需继续稀释。

表1 pAdEasy-EGFP-SERCA2a滴度测定(TU/mL)

1.5重组腺病毒的扩增与纯化取原代重组腺病毒上清液，反复感染HEK293细胞，在37℃、5% CO2培养箱中培养，镜下观察到95%～100%细胞出现病毒感染时，收集细胞，用-70℃和37℃反复冻融3次，收集上清液。重组腺病毒病毒加入到纯化柱，进行纯化，洗涤后收集到无菌的EP管中，-80℃保存。

2 结果

2.1hSERCA2a基因PCR鉴定得到与预期大小一致的目的条带，条带大小为2 998 bp，证明重组腺病毒载体上含有hSERCA2a特异性目的片段(图1)。

2.2pAdEasy-EGFP-SERCA2a酶切鉴定SalⅠ+SacⅡ双酶切能切出2 998 bp左右片段的阳性克隆，酶切结果表明目的基因hSERCA2a已成功克隆至载体质粒(图2)。DNA测序鉴定结果表明hSERCA2a基因序列完全正确(图3)，证明重组腺相关病毒pAdEasy-EGFP-hSERCA2a载体构建成功。

2.3病毒转染HEK293细胞结果重组腺病毒质粒pAdEasy-EGFP-hSERCA2a转染HEK293细胞24 h后，荧光显微镜发现转染成功的细胞中明显有绿色荧光出现(图4a)；转染 48 h，可见大部分细胞转染成功，明显的绿色荧光聚集(图4b)，图4a、4b对应的普通光镜下的白光图见图4c、4d。

M: marker；1：阴性对照；2：腺病毒hSERCA2a PCR扩增；3：阳性对照

M: marker；1：pAdEasy-EGFP-SERCA2a用SalⅠ+ SacⅡ双酶切。

2.4重组腺病毒的滴度测定重组腺病毒转染HEK293细胞72 h收集病毒，病毒浓缩液滴度测定，病毒滴度测定结果显示滴度为1×1012μg/mL。

图3 SERCA2a基因序列测序鉴定

3 讨论

SERCA2a是参与钙离子调节的主要蛋白，主要存在于心肌和骨骼肌中，其功能是ATP依赖性地逆浓度梯度将钙离子由胞浆排入肌浆网内，促进心肌舒张。Ca2+在调节心脏的收缩和舒张过程中具有重要的作用。

近年国内外转导SERCA2a基因治疗心力衰竭的作用得到了一致肯定[2]。SERCA2a基因能稳定肌质网 Ca2+浓度和降低肌质网 Ca2+丢失，减少心力衰竭心肌细胞的触发活动[3]。随着心血管疾病发生机制的分子生物学深入研究，认识到基质网钙(SR)浓度的降低是心力衰竭时的显著特征，基质网钙离子浓度的降低将导致在电机械收缩过程的钙离子释放减少和心肌收缩力的降低，钙离子调控失常主要基于2个原因：(1)SERCA2a的表达降低是因为肌浆网钙ATP酶协助SR对钙离子的摄入；(2)SR钙离子释放通道或心脏ryanodine受体的渗漏[4]。心衰基因治疗的一项基本策略是将SERCA基因转入心衰的心肌细胞，使心肌组织中肌质网SERCA表达量提高，改善心肌舒缩功能[5]。

a、b分别为rAd-SERCA2a-EGFP转染后24、48 h绿色荧光图；c、d分别为相对应视野下的白光图

大量研究表明，在衰竭的心肌细胞中，SERCA2a mRNA的表达量及SERCA2a的活性与正常心肌相比降低30%[6]。基础研究表明，腺病毒载体将兔肌质网SERCA2a基因转入大鼠心肌细胞，SERCA2a转染的大鼠心肌细胞内SERCA表达水平明显提高， 且活性增强[7]。Li等[8]的实验研究通过腺病毒将SERCA 2a基因同时导入大鼠和兔心肌细胞，发现兔和大鼠的心功能发生明显改善尤其是收缩功能，阻止了心衰的进一步发展。SERCA2a的转基因治疗可调节晚期心力衰竭患者心肌细胞内钙循环，伴随着SERCA2a的活性和表达量的增加及心肌细胞的SERCA2a水平的恢复，心肌细胞的收缩和松弛功能得到明显的改善，进而恢复和拯救心衰心肌。

本研究成功地构建携带hSERCA2a基因的重组腺病毒载体，建立了稳定可靠的借助HEK-293细胞培养并纯化高效价的rAd-hSERCA2a-EGFP重

组体的方法，对重组腺病毒携带其他基因的扩增与提纯方法具有一定的参考价值。本研究通过携带SERCA2a基因的腺病毒载体感染心肌细胞可使心肌细胞内的SERCA2a基因的表达上调。rAd-hSERCA2a-EGFP重组体可直接用于心血管疾病的动物实验研究，因腺病毒表达周期短，所以腺病毒载体介导的SERCA2a基因过度表达能够短期有效地增强心脏功能，改善心肌舒缩功能，为心力衰竭的动物实验及临床试验基因治疗研究提供新方法。

参考文献：

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