新疆地区哈萨克族和汉族人群中GGCX基因多态性分析

夏依扎·卡玛力， 木胡牙提， 卢武红， 刘志强， 何鹏义， 杨玉春

(新疆医科大学第一附属医院综合心脏内科， 乌鲁木齐 830054)

γ-谷氨酰基羧化酶(γ-glutamyl carboxylase,GGCX)是维生素K循环中的关键酶, 其功能是催化凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ 的γ- 羧基化作用, 其作用的发挥依赖于维生素K和O2。当还原型维生素K和O2存在时, GGCX将CO2掺入特异的谷氨酸残基中, 反应产生γ- 羧基化的谷氨酸; 同时产生维生素K 2, 3- 环氧化物[1]。近期的国内外研究表明,GGCX是影响口服抗凝药华法林用量个体差异的遗传因素之一,其中研究较多的有GGCX(rs12714145)、GGCX(1181T→G)及GGCX 3261G>A位点的多态性与华法林用量个体差异的相关性[2-4]。为了解GGCX的2个单核苷酸位点(rs11676382和rs6751560)基因多态性在新疆地区哈萨克族、汉族人群中的分布情况,本研究应用多聚酶链反应-限制性内切酶长度片段多态性 (PCR-RFL P)技术对新疆医科大学第一附属医院305例哈萨克族和305例汉族健康体检者GGCX的2个单核苷酸位点基因型进行检测，计算基因分布频率，并进行分析和比较。

1 资料与方法

1.1一般资料随机选取2011年1月-2012年12月在新疆医科大学第一附属医院进行健康体检的哈萨克族和汉族人群各305例,其中哈萨克族男性147例,女性158例；汉族男性150例，女性155例,年龄18～80岁。

1.2方法

1.2.1 样本采集与DNA提取 抽取受检者外周静脉血5 mL,EDTA-Na2抗凝。标准酚-氯仿法提取基因组DNA,核酸蛋白分析仪(Eppendorf Biopho-tometer)检测样本DNA纯度和浓度后于-20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 设计一对引物扩增包含GGCX rs11676382、rs6751560位点的片段(表1)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR扩增在C1000TMThermal CyclerPCR仪上进行,20 μL PCR反应体系含: PCR Master mix(2X)10 μL,上、下游引物各0.5 pmol,ddH2O 7.5 μL,基因组DNA 2 μL。循环参数:95℃预变性3 min,95℃变性30 s,60.8℃(rs11676382)、59.0℃(rs6751560)退火30 s,72℃延伸 1 min,共35个循环;最后72℃总延伸5 min。PCR反应结束后,取10 μL扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶上电泳,观察PCR产物的特异性和片断大小。

表1 扩增目的基因及位点、引物序列、退火温度及产物长度

1.2.3 酶切分型 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)的方法。(1)HindⅢ内切酶用于消化rs11676382位点的扩增产物：取10 μL PCR 扩增产物 ，10×buffer R 2 μL，HindⅢ 1 μL，ddH2O 7.5 μL,37℃ 下水浴过夜。 (2)BsrI内切酶用于消化rs6751560的扩增产物： 取10 μL PCR 扩增产物，10×buffer B 2 μL，ddH2O 7.5 μL，BsrI 1 μL，65℃下水浴过夜。 (3)2%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物：取 10 μL酶切产物加入 2%琼脂糖凝胶负极端的加样孔，以6×DNA Loading Buffer(Bromophenol Blue)为染色剂，在120 V 电压下电泳25 min，100 V 电压下电泳10 min，80 V 电压下电泳15 min，在紫外线灯下观察带型。

1.3统计学处理采用基因计数法计算 GGCX rs11676382、rs6751560基因型及等位基因频率。采用SPSS18.0 统计软件对数据进行处理。不同民族人群基因分布情况的比较用χ2检验。所有数据用χ2检验判断GGCX的等位基因频率和基因型频分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1基因型检测经PCR扩增后GGCX rs11676382位点基因目的片段大小为283 bp,rs6751560位点基因目的片段大小为304 bp。根据酶切情况，rs11676382位点基因型有3种：野生型CC有167 bp和116 bp 2个条带，杂合型CG有167 bp、116 bp和283 bp 3个条带，突变型GG有283 bp 1个条带(图1及图3)；rs6751560位点基因型有3种：野生型AA有304 bp 1个条带，杂合型AG有61 bp、103 bp、140 bp和304 bp 4个条带，突变型GG有61 bp、103 bp和140 bp 3条带(图2及图4)。

M:DNA Marker; 1～6: 加PCR扩增产物

M:DNA Marker; 1～6: 加PCR扩增产物

M:DNA Marker; 6,8,13: CC基因型； 1～5,7,9～12,14: CG基因型； 15: GG基因型

M:DNA Marker; 9:AA基因型；AA: AG基因型； 1～8,10,12: GG基因型

2.2GGCXrs11676382、rs6751560位点等位基因和基因型分布rs11676382基因型CC、CG和GG在哈萨克族人群中分别有66例(21.64%)、233例(76.39%)和6例(1.97%),C和G等位基因的频率分别为59.84%和83.50%；在汉族人群中分别有209例(68.30%)、93例(30.39%)和4例(1.31%),C和G等位基因的频率分别为40.16% 和16.50%。rs6751560基因型AA、AG和GG在哈萨克族人群中分别有2例(0.66%)、11例(3.61%)和292例(95.74%), A和G等位基因的频率分别为2.46%和97.54%；在汉族人群中AA、AG和GG分别有4例(1.31%)、3例(0.98%)和298例(97.70%), A和G等位基因的频率分别为1.80%和98.20% (表2)。

2.3不同民族GGCXrs11676382、rs6751560位点基因多态性分布情况的比较新疆地区哈萨克族与汉族人群rs11676382位点基因型比较差异有统计学意义(总χ2=134.9，P<0.01)，显性模型CC与CG+GG、隐性模型GG与CC+CG、附加模型CG与CC+GG之间比较显示，显性模型和附加模型比较差异有统计学意义(χ2=134.4和129.9，P<0.01)，等位基因C与G比较差异有统计学意义(χ2=84.3，P<0.01)。rs11676382位点隐性模型比较差异无统计学意义。新疆地区哈萨克族与汉族rs6751560位点基因型比较差异无统计学意义(χ2=5.30，P>0.05)，等位基因A与G比较差异无统计学意义(χ2=0.63，P>0.05)，见表2。

表2 GGCX基因rs11676382、6751560位点基因频率和等位基因频率比较/例(%)

3 讨论

基因有遗传效应的DNA片段是控制生物性状的基本遗传单位。基因有2个特点:(1)能忠实地复制自己，以保持生物的基本特征；(2)基因能够“突变”，突变绝大多数会导致疾病，另外的一小部分是非致病突变。基因型又称遗传型，某一生物个体全部基因组合的总称。等位基因(allele又称作allelomorph)一般指位于一对同源染色体的相同位置上控制着相对性状的一对基因。等位基因频率是群体遗传学的术语，用来显示一个种群中基因的多样性，或者说是基因库的丰富程度[5-8]。

目前国内外有关基因多态性与某种疾病相关性、基因型对临床上某种药物需求量的影响等研究较多，其结果对临床医师在临床上对疾病的治疗及个体化用药起到了不可忽视的作用，如华法林(Warfarin)是目前在临床上常用的抗凝药,用于瓣膜病、瓣膜置换、非瓣膜病性房颤、电复律、冠心病、肺栓塞和深静脉血栓形成等的抗凝治疗[9]。但华法林用量存在个体差异,若剂量大，有严重出血的危险[10-11]。诸多国内外研究显示除了遗传、环境、药物、疾病等因素外，基因多态性在华法林个体用药方面起一定的作用[12-13,14-24]。

研究某个群或多个群基因多态性，且进一步行基因多态性与临床药物剂量需求的相关性研究，对临床医师在临床上个体化用药有很大的帮助。

本研究结果显示，新疆地区哈萨克族与汉族人群rs11676382位点多态性均以CC和CG基因型比较常见，C等位基因出现的频率比G等位基因出现的频率高；CC基因型是保护因素，而CG基因型是危险因素，GG基因型既不是保护因素，又不是危险因素。rs6751560位点显示：2个民族人群中GG基因型常见，A和G等位基因出现的频率相等。

本研究利用PCR-RFLP技术，对新疆哈萨克族和汉族人群γ-谷氨酰基羧化酶的rs11676382和rs6751560SNP位点初步进行了检测分析，发现其不同的基因型及基因型分布频率有差异，将来需要进行更多的相关性研究，使其为临床及患者服务。

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