大鼠慢性牙周炎与IgA肾病复合模型肠系膜淋巴结中浆细胞的表达及其意义

李 静， 地里木拉提·阿不都拉， 李团结， 刘 健， 桑晓红

(新疆医科大学第一附属医院肾病科， 乌鲁木齐 830054)

IgA肾病是IgA或以IgA为主的免疫球蛋白弥漫沉积于肾小球系膜区毛细血管袢为主要特点的原发性肾小球肾炎。研究表明慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)促进IgAN的病情进展[1]，但其具体影响机制目前尚缺乏研究。肠系膜淋巴结是免疫应答的重要部位，其浆细胞在慢性牙周炎症状态下是否表达增加，并促进肾功能及免疫病理损伤是需要探讨的问题。本研究通过建立大鼠IgAN合并CP模型，观察评价组间的血肌酐、尿素氮、蛋白尿及肠系膜淋巴结的病理改变，以探讨肠系膜淋巴结中浆细胞的表达变化及其在IgAN病情进展中的意义。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组健康清洁级雄性SD大鼠40只[由新疆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SOXK(新)2011-0001]，体质量(200±20)g，饲养于新疆医科大学动物研究中心(AAALAC)，20℃恒温、恒湿环境，自由摄食1 w。SD大鼠随机分为对照组、CP组、IgAN组及复合组(IgAN+ CP)4组，每组10只。

1.2主要试剂与仪器脂多糖(LPS，美国Sigma公司)，牛血清白蛋白(BSA，美国MPBIO公司)，四氯化碳(CCl4，苏州百与化工有限公司)，FITC标记的兔抗鼠IgA抗体(美国Dako公司)。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromanus gingivalis, Pg)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa)由四川大学华西口腔医学院口腔微生物重点实验室提供。

1.3造模方法IgAN组：参考张静等[2]的IgAN造模方法，将BSA以蒸馏水配制成100 g/L浓度，剂量600 mg/kg体质量，隔天灌胃，持续12 w；CCl4注射方式：皮下注射蓖麻油0.3 mL+CCl40.1 mL，每周1次，持续12 w，联合LPS(第8 周LPS 0.05 mg尾静脉注射)。 CP组：腹腔麻醉大鼠，充分暴露双侧上颌磨牙，牙根部用接种有Pg、Aa的混合菌株结扎线结扎，丝线尽量放入龈沟内； 1 w涂1次，连续8次，丝线脱落，随时结扎，重新涂抹细菌[3]。复合组建立IgAN+CP动物模型：在建立IgAN大鼠模型的基础上，于第4周开始建立CP动物模型的操作。对照组：生理盐水4 mL/kg体质量灌胃，皮下注射生理盐水0.4 mL，频率同其他各组。

1.4检测指标观察大鼠一般情况，每周称体质量，检查丝线情况，若脱落重新结扎。每日观察大鼠饮食、精神活动状态。处死前动物禁食12 h，放代谢笼收集24 h尿液，检测24 h尿蛋白定量；腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min,分离上清液，检测血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)。余血液离心取上清液,分装离心管中,密封遮光, -70℃保存待用。肠系膜淋巴结组织10%中性甲醛固定24 h后常规脱水透明，石蜡包埋，常规HE染色。部分肾组织于10%中性甲醛固定24 h后常规脱水透明，石蜡包埋，切片片厚2 μm，常规PAS染色。其余肾组织标本加少许OCT包埋剂，切片片厚4～5 μm，室温干燥，冷丙酮固定，洗片，直接免疫荧光法测肾小球IgA沉积强度。

2 结果

2.1各组大鼠的一般情况对照组大鼠精神活跃，皮毛光洁。其他各组大鼠在尾静脉注射LPS后，大鼠精神状态萎靡，毛色变黄、蓬松散乱，体质量不增或减轻，5 d左右症状缓解。

2.2各组大鼠24h尿蛋白定量、Scr、BUN水平比较CP组与对照组比较，24 h尿蛋白定量、Scr、BUN差异无统计学意义(P>0.05)。IgAN组、复合组各项指标均高于对照组、CP组，差异均有统计学意义(P<0.05)。复合组24 h尿蛋白定量、Scr 、BUN均高于IgAN组，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠24 h尿蛋白定量及肾功能水平

注：与正常对照组比较，★P<0.05；与CP组比较，▲P<0.05；与IgAN组比较，△P<0.05。

2.3各组大鼠肾组织病理学改变对照组肾小球系膜无增生，无新月体，肾小管无萎缩，肾间质无炎性细胞浸润(图1a)。与对照组比较，IgAN组均出现不同程度肾小球局灶系膜增殖，偶可见球囊粘连、局灶纤维化和炎细胞浸润(图1b)；复合组较IgAN组大鼠病变明显加重，肾小球内基底膜增厚、粘连严重，肾小球局灶阶段性硬化，偶见新月体形成，肾间质纤维化较重，肾小管上皮细胞萎缩，管腔扩张，炎细胞局灶性或弥散浸润(图1c)；肾组织免疫荧光病理：对照组未见IgA沉积(图1d)，IgAN组肾小球系膜区可见IgA团块状沉积，荧光强度为(+++)(图1e)，复合组肾小球系膜区可见IgA团块状沉积，荧光强度为(++++)(图1f)。

2.5各组大鼠肠系膜淋巴结的病理学改变与对照组相比，IgAN组光镜下可见被膜下窦内散在浆细胞，复合组中可见较多浆细胞产生，见图2。

b: IgAN组(PAS×200)

c: 复合组(PAS×200)

d: 对照组(×200)

e: IgAN组(×200)

f: 复合组(×200)

a:对照组(HE×100)

b: IgAN组(HE×200)

c: 复合组(HE×200)

3 讨论

Itoh等[4]报道35%～40%的IgAN患者有上呼吸道感染，尤其是常伴有扁桃体炎的患者。IgAN是一种黏膜免疫异常的疾病，CP可以增加全身的炎症负荷[5]。患牙周炎的个体有慢性、反复发作的低水平菌血症[6-7]，由于牙周致病菌长期存在并产生致炎物质，进而损伤口腔黏膜，也与黏膜免疫有关。王左敏等[8]研究表明，牙周炎患者其血清IgA、IgG较正常人高。肠系膜亦属于黏膜免疫的范畴，是否是通过黏膜免疫系统相互影响，目前还缺少研究证据。

本实验建立CP+IgAN复合模型及对照模型，在复合组中可以见到大鼠上颌磨牙牙周炎改变，同时IgAN组及复合组均出现蛋白尿、肉眼血尿，肾组织出现系膜增生、肾小球IgA荧光沉积等病理学改变，结果说明SD大鼠成功建立牙周炎及IgAN模型。

本研究结果显示，复合组大鼠24 h尿蛋白定量、Scr、BUN、肾脏病理改变均较IgAN组严重，提示慢性牙周炎可能加重IgAN的肾脏功能的进展。而复合组中的肠系膜淋巴结中浆细胞显著多于IgAN组和CP组，提示浆细胞可能是两者之间相互影响的一个重要因素。

浆细胞是抗原应答B细胞的成熟细胞，免疫球蛋白主要是由脾脏、淋巴结和淋巴组织内的浆细胞产生的, 肠系膜淋巴结为黏膜免疫应答的诱导部位[9]。有研究表明血清异常升高的 IgA 并非由黏膜产生，而是由黏膜内抗原特定的淋巴细胞或抗原递呈细胞进入骨髓腔，引起骨髓 B 细胞分泌 IgA 增加[10]。最后沉积于肾小球系膜区，产生一系列肾脏临床及病理改变。本研究表明复合组中肠系膜淋巴结中浆细胞明显增加，说明牙周炎时体内慢性感染状态可能刺激肠系膜淋巴结内浆细胞增生，并且通过黏膜免疫应答导致IgA分泌增多且沉积于肾脏，从而促进IgA肾病的发生及进展，但IgA肾病发病及进展因素比较复杂，具体机制及影响途径可能有多种因素影响，需要进行进一步的研究与探讨。

参考文献:

[1] 李静，张静，刘健，等.慢性牙周炎与IgA肾病复合动物模型的建立及相互关系[J].中华肾脏病杂志，2013，29(11)：842-848.

[2] 张静，李静，桑晓红，等.运用两种BSA剂量建立IgA肾病大鼠模型观察[J].中国中西医结合肾病杂志，2013，14(1)：13-16.

[3] 李静,桑晓红,刘健,等. 大鼠慢性牙周炎与慢性肾衰竭模型的建立及相关性研究[J].中华肾脏病杂志, 2010,26(8)：619-623.

[4] Itoh A，Iwase H, Takatani, et al.Tonsillar IgA as a possible source of hypoglycosylated IgA in the serum of IgA nephropathy patients[J].Nephrol Dial Transplant,2003,18(6)：1108-1114.

[5] Craandijk,Van Krugten MV,Verweij CL,et al.Tumor necrosis factor-alpha gene polymorphisms in relation to periodontitis [J]. Clin Periodontol, 2002, 29：282-341.

[6] Yoshihara A, Sugita N, Yamamoto K, et al.Analysis of vitamin D and fcgamma recep tor polymorphisms in Japanese patients [J]. Dent Res,2001,80：20512-20541.

[7] Marakoglu I.Periodontal status of chronic renal failure patients receiving hemodialysis[J]. Yonsei Med,2003, 30:44(4)：648-656.

[8] 王左敏，司燕，张菁，等.牙周炎与慢性阻塞性肺疾病关系的初步研究[J].实用口腔医学杂志，2009，25(4)：497-500.

[9] 谢遵江,刘文庆,方传龙,等.小鼠回肠集合淋巴小结在黏膜疫应答中的形态学研究[J].哈尔滨医科大学学报,2001,35(5)：339-341.

[10] Barratt J，Feehally J，Smith AC.Pathogenesis of IgA nephropathy[J].Semin Nephrol，2004，24(3)：197-217．